ウエスタンで

質問

サンプルの蛋白をBufferで補正する意味を教えてください。
自分の頭の中では同じような比率になるように薄めると定量性がなくなるんではないか？と思ってしまうのですが。。

回答No.2

pi3-kinase · ベストアンサー

確かにそれは感心しませんね。あなたがおっしゃるように、タンパク定量をして、等量をウェスタン解析にまわすというのが王道だと思います。もしくは、βアクチンとかサンプル間で振れない蛋白質のブロットも行って、目的のバンドとインターナルコントロールのバンドを定量して、ノーマライズするとかですね。私は、ウェスタンは基本的に定量性に欠けるのでしませんが・・・。繰り返しになりますが、やはり最初にタンパク量を揃えるべきでしょう。

お礼

ド素人なもので、疑問が多いです。参考になりました！回答ありがとうございました！

回答No.3

Chicago243

実験にもよるでしょうが、チョット無理があるかもしれませんね。きっとローディングコントロールがそろった状態でデーターを見たいということだと思いますが、、、
あなたの実験でそのローディングコントロールでよしとされているならば、そういうのもありでしょう。いろんな状態からサンプリングするため、原液のばらつきがコントロールできないのかもしれませんね。とにかく、原液のタンパク量をはかって合わせるのがベターなのは事実です。ローディングコントロールで補正して流し直したときは、そのときだいたい同じタンパクがのっているかをCBBとかアミドブラックとかで見ておいた方がいいかもしれません。
それか目的によっては、ローディングコントロールがそろっていることより、原液をそのまま等量のせるほうが意味がある場合もたしかにあります。

お礼

今まで補正なんてしなかったもので、よく分からなくて。
回答ありがとうございました！

回答No.1

pi3-kinase

各サンプルの蛋白質濃度を測定し、等量をロードする
という意味ですか？

補足

はい、そうです。一回ウエスタンしたものを、もう一回補正してそろえ、希釈しなおすという作業で・・
原液でないと定量できないんじゃ？と思うのですが、私は何か勘違いをしていると思います。。