westernの常識

質問

invitrogenのプロトコロールに「還元下」と「非還元下」条件でのサンプル調整法が載っています。
還元下では、１０Xの還元剤を入れるようです。
しかし、SDSランニングバッファーを使っていますので、還元下での実験と思っていましたが、SDSを使っても「還元」と「非還元」という条件があり得るのでしょうか。
また、通常、還元剤は使うべきものなのでしょうか。
今までは、使っていませんでした。

回答No.4

blackdragon · ベストアンサー

#1です。

SDS-PAGE自体は還元状態で行なうことが多いですが、WesternのためのSDS-PAGEの場合は、どちらとも言いがたいようですね。要は、目的と、使用する抗体の性質によるということのようです。（還元状態では反応しない抗体があるのも確かですし、逆に、非還元ではきれいに泳動されないものもありますから。）

使う抗体が市販のものなら、どちらで行なうべきか（どちらでも良いものが多いと思いますが）を、添付資料等でチェックしてみてはいかがでしょうか。

あと、#1で、2-メルカプトメタノールと書いたのはミスタイプで、正しくは、2-メルカプトエタノール（β-メルカプトエタノール）です。

お礼

再度ご回答いただき、ありがとうございました。
市販の抗体ですので、データシートを見てみたのですが、特に還元・非還元についての記載はありませんでした。
通常、多量体でない蛋白について、S-S結合を切ってから流しても問題ないのでしょうか。

回答No.3

noname#24872

No.2です。

Invitrogenのプロトコロールがあるとのことなので、回答の必要も無いかと思いますが‥‥‥。

>「還元剤を使うなら、抗酸化剤がいるんじゃない？」と先輩が言ってました。言ってる意味がわからなかったのですが。

私にも分かりません。還元下で行う場合は、単にサンプルバッファーに還元剤（2MEもしくはDTT）を加えるだけです。泳動後の操作は、還元・非還元とも全く同じです。

後輩は、あまり先輩をいぢめてはいけません。

回答No.2

noname#24872

>SDSを使っても「還元」と「非還元」という条件があり得るのでしょうか。

No.1の方が書かれているように、「還元」と「非還元」の違いは、ペプチドのＳＳ結合を「切るか」「切らないか」です。

通常、ＳＤＳ電気泳動は還元下で行うのが普通です。しかしウェスタンの場合、泳動後に目的のペプチドを抗体を使って検出しなければなりません。

ＳＳ結合は、ペプチドの立体構造を維持するのに役立っている場合が多いので、ＳＳを切ってしまうと、ＳＤＳを除いても元の三次・四次構造が復元しないことがよくあります。この場合、抗体との親和性も失われることになります。

>また、通常、還元剤は使うべきものなのでしょうか。

したがって、ウェスタンでは還元剤を入れないで電気泳動するのが普通です。もっとも、あらかじめＳＳを切っても抗原性が失われないことが分かっていれば、還元剤を使っても何ら問題ありません。

お礼

そうだったのですか。
No1の方は、通常「還元下」で行うと仰っています。
一方、私たちのラボでは、今まで還元剤を購入した形跡はありません。
なぜか、抗酸化剤はあり、「還元剤を使うなら、抗酸化剤がいるんじゃない？」と先輩が言ってました。
言ってる意味がわからなかったのですが。

回答No.1

blackdragon

還元下で行なうことが多いと思います。

S-S結合を、保持したままにしたいか、切った状態にしたいかということです。（還元条件にすると切れる）

SDS-PAGEでは、還元剤はランニングバッファーに入れるのではなく、サンプルバッファーに入れますね。2-メルカプトメタノールやDTTなどを入れることが多いです。
S-S結合で形成される多量体を、多量体のままで泳動したい時などは、還元剤を入れずにやります。

お礼

ご回答いただき、ありがとうございました。
仰るように、SDSはサンプルバッファーに４％含まれており、最終的には２％になるように調整しておりました。
多量体のまま泳動する必要がなければ、原則還元剤を入れるべきなのですね。
今まで入れていませんでした。
バンドが太い時もあれば、細い時もありました。
還元剤を入れれば、常に細いきれいなバンドになるのでしょうか。