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oligo(dt)15 Primerの配列は、単にTを15個つなげた配列でいいのでしょうか?

私は今、RT-PCRを行っています。 現在はOligo(dt)15プライマーを使って逆転写をしているのですが、このプライマーはなかなか高価ですよね。 なので自分でOligo(dt)プライマーを設定して注文すればかなり安いと思ったのです。 そこで質問なのですが、このプライマーの配列は「TTTTTTTTTTTTTTT」で注文してしまっていいのでしょうか? 回答よろしくお願い致します。

  • dekon
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回答No.1

RTのあとのPCRのデザインによってはそれで良いですし、これまで使ってこられたのもそういうプライマーだったのかと思いますが、どうせオーダーメイドなら一工夫しても良いと思います。 これが効いてくるのは、特に3'RACEのときで、Gene specific primer対でPCRするだけならあまり関係ないのですが、 1. 5'-(dT)n-(A or C or G)'とか、 5'-(dT)n-(A or C or G)-N-3'のように、3'末端の1~2塩基ををdegenarateする。こうするとoligo-dTがpoly-A tailの根元に付いたものだけのcDNAが逆転写される。単純に(dT)nだけだと、poly-A tailのいろいろな位置からプライミングされてしまうため、長さが微妙に異なるPCR産物の混合物になってしまう。なお、3' RACEにoligo dTをプライマーを使うときも、このようにdegenerateしたものを使ったほうがよい。 2.(dT)nの5’側にユニークなアンカー配列をデザインする。(dT)nだけだとTmが低くすぎて、PCRに支障をきたす。また、アンカー配列に対するプライマーを使えばよりreliableだし、必要ならnested PCRもできて便利。 clontechのMarathon kitのプライマーデザインが参考になるかと思いますので、マニュアルpdfのリンクをはっておきます。なお、プライマー合成のとき、degenerate nuleotideを入れるのは、ふつう追加料金なしです。

参考URL:
http://www.clontech.com/clontech/techinfo/manuals/PDF/PT1115-1.pdf
dekon
質問者

お礼

とってもわかりやすい回答をどうもありがとうございました。 教えていただいたプロトコルを見ると、とくに修飾なくそのままTの配列を並べた設計でよいみたいです。 さっそく設計してプライマーを注文してみます。

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