スメアーなバンド

質問

特定の遺伝子の組織ごとのRNA発現量を調べるために、RNA抽出を行い、ｃDNAライブラリーを作成し、PCRを行っています
今、そのPCRでのサイクラーの条件設定に悪戦苦闘しています
ファーストプライマーでPCRを行ったものはきれいなバンドが出るのですが、このPCR産物をテンプレートに行ったネスティッドプライマーでのPCRでは、目的の230bpの位置にバンドが出るのですが、バンドがを引くようになってしまいます
この画像を使ってNIH　Imageによって画像解析をおこないたいので、くっきりしたバンドを得たいのですが、どのような原因でこのようになるのか分かりません
ネスティッドPCRのアニーリング温度は、61.4℃ではバンドがかなり薄くなり、61.1℃では200bpくらいにわたって尾を引く感じのバンドになります
くっきりしたバンドを得るにはどのようにしたらいいのでしょうか？
アドバイスよろしくお願いします

回答No.3

MIYD · ベストアンサー

#1と#2の補足部分を読んでもよく分からないのですが、
2回目のPCRが25or35サイクルなのでしょうか。
1回目のPCR反応物をどのくらい持ち込んでいるのでしょうか。

1回目のPCRでバンドが見えているのですよね。

ということは泳動しているPCR反応物中に少なくとも数ngの目的のPCR productが入っているということになります。
目的のPCR product 何ng分を2回目のPCRにかけていることになるのでしょうか。

>アプライ量は反応液50μl中、1μl
というのが1回目のPCR反応物の持ち込み量とすると、
(loading量は7ulなんですよね)
1ng前後は持ち込んでいるのでしょうか。

25サイクルのPCRによって、約10^25つまり約3.4*10^7倍に増えますので、
(プライマーに挟まれていない産物もありますので本当はもう少し減りますが)
1ngのテンプレートは34mgに増えることになります。
35サイクルだと約34gに増えることになります。

そんなに増えるだけのプライマー、dNTPなどは入っていないと思います。
増幅が頭打ちになった後は、PCR産物同士のdenature,アニーリングが繰り返されたりして、スメア状になります。

1回目のPCRで見えている目的のバンドを25サイクルの反応に耐えるだけの薄さに希釈しているのでしたら、
そこで誤差が生じやすくなります。

RT-PCRの都合などでnestedをかける必要があるのでしょうか。

お礼

回答ありがとうございました

そうですよね、そもそもRT－PCRで定量するのだからネスティッドまで行う必要が全くないのですよね

かなり的確なアドバイス本当にありがとうございました
あまりの無知さに自分でも恐いです・・・

いつもいつも、丁寧なアドバイスにかなり助けられています　　この感謝は言葉では言い表せませんが本当にありがとうございます

回答No.2

riibou

スメアになるのはアプライする量が多いか、サイクル数が多いせいと考えます。
　もし、annealing温度が61.4℃でバンドが薄くても比特異が出ていないのであればそれでサイクル数を増やすか、61.1℃でサイクル数を減らしたらどうでしょうか？

補足

回答ありがとうございます

アプライ量は反応液50μl中、1μlです
サイクル数は今まで35回だったので、25回で行ってみたら、バンドが薄くなっただけで、スメアーのままでした

結果からみて、サイクル数を変えてもスメアーは改善されないようです

回答No.1

MIYD

nestedのPCRは何サイクル回しているのでしょうか。
回しすぎるとスメアになります。
loading量が多くても尾を引きます。
電気泳動時の電圧が高くても尾を引きます。

アガロースゲルではなくて、PAGEで流すと綺麗になるかもしれません。

ファーストプライマーで綺麗なバンドが出るのでしたら、
それで定量することは出来ないのでしょうか。
nestedPCRで誤差が大きくなることはあっても、
精度があがることはないと思います。

補足

回答ありがとうございます

PCRは35サイクル行っています
loading量は、６×の色素1,5μlに７μlのPCR産物で行っています
電圧は１００Vです

＞nestedPCRで誤差が大きくなることはあっても、
精度があがることはないと思います

そ、そうなんですか・・・PCRが一回で済むのなら願ったり叶ったりです
それを考慮に入れて、とりあえずバンドの尾がなくなるか、サイクル数を２５回、loading量を５μlにして試してみます