免疫染色の抗体前吸収処理について

質問

免疫染色の時、抗体の特異性の確認のために、ターゲットのペプチドなどで前吸収する処理がありますが、いくらペプチドの濃度を上げても、なんだかシグナルが残ってしまいます。。。。

抗体のメーカーに聞いたところ、
4℃オーバーナイトでインキュベート後に、遠心処理をして、免疫複合体を沈殿させなさい、といわれました。

抗体と抗原がくっつくと不溶化するものなんでしょうか？それを遠心して除かないと、シグナルが消えないのはあたりまえ？

誰か教えてください。

回答No.1

ga111 · ベストアンサー

＞抗体と抗原がくっつくと不溶化するものなんでしょうか？

不溶化する場合としない場合あり。ペプチドだと不溶化しない場合が多いかも。

ペプチドを固定化してそれに抗体を吸着させることがかんがえられます。

お礼

ご回答ありがとうございます。

固定化というのは具体的にはどのようにするのでしょうか？
特殊なプレートなど必要ですか？
ご意見いただければ幸いです。

回答No.5

ga111

>このような場合は、aminolinkまたはmicrolinkで固定化すると良いのですね？

反応可能な遊離基があれば、うまくいく「かも」。いかないこともあります。

免疫染色がウエスタン（分子が小さすぎ？！）なのか細胞染色なのかよく分かりませんが。両方、ペプチドをいれて抗体をいれればいいような気がしますがねえ。

細胞（組織）染色だと、蛍光を使った場合、顕微鏡や画像処理ソフトで弱いシグナルが強く補正されてしまうことがありますけど、、、また、endothelin-1は分泌されて（？）細胞（組織）にとどまらないような気が？レセプターとendothelin-1複合体をみるのでしたら、endothelin-1がうまく固定されてないとやばいですよね。（はずしてるかも）

補足

組織染色を行なっております。
多くの論文が上手く染めているようなので、特に疑問を感じずに行なっています。
アセトン固定であれば細胞内のペプチドが流出しないと聞いているものですから。。。

回答No.4

ga111

http://www.technochemical.com/pierce/immobilization/immblztn.htm

あなたのペプチドに反応可能な遊離基が必要です。

私なら、固定化カラムに吸着したものとしないもので充分な差が出ればよしとします。

お礼

ペプチドというのは、endothelin-1で、アミノ酸配列は、Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp です
(Disulfide bonds between Cys1-Cys15 and Cys3-Cys11)。

このような場合は、aminolinkまたはmicrolinkで固定化すると良いのですね？

遠心しても上手くいかない時は試してみます。

ありがとうございました。

回答No.3

geneticist12

2です。

Protein A/Gだと非特異的抗体も区別せずにくっついてしまうのでだめですね。勘違いです。失礼しました。

お礼

ご回答ありがとうございます。

確かに非特異的反応の可能性もございます。。。
慎重に結果を解釈したいと思います。

回答No.2

geneticist12

確実に沈殿させるなら、Protein AまたはG（担体に結合させたものならなお効果的）を加えると良いかと思います。

どれだけまで過剰の抗原で吸収させておられるのかわかりませんが、本当に十分量いれてもシグナルが残っているなら、まさに非特異的抗体が反応しているという可能性を示しているのでは。まず、抗体をアフィニティー精製するとか、非特異的抗体を吸収で除くとかしてからやった方がいいかもしれません。