血糖値（グルコース）測定値に対する溶存酸素の影響について

質問

自分で血糖値を測定する自己血糖測定器がいま色々出ていますが
グルコース酸化酵素ＧＯＤを使った測定器は
血中の酸素分圧が高い血液だと、
血糖測定値は低くなるのは、
なぜなのかメカニズムを教えてください。
溶存酸素がたくさんあるほうが、
よりグルコースが酸化されて測定値は高くなりそうな気がします。

回答No.11

anisol · ベストアンサー

いろいろ調べたところ、ほぼ解決しました。（私は調べることしかできないので）

アメリカ電気化学会発行のInterface誌に次の説明があります。参考URLのPDFファイルの3ページ目です。（一応訳をつけましたが、いいかげんなので、原文を読んでください）

The ferricyanide is not as efficient at shuttling electrons with the enzyme as oxygen; therefore, any oxygen in the solution can compete effectively for the enzyme site, producing a signal that is related to glucose, but not in the same way as the ferricyanide-mediated signal.
フェリシアン化物は酸素ほど効率的に電子を運ばないので、溶液中の酸素は酵素のサイトに競合し、グルコース量と関連する信号を発生するが、フェリシアン化物による信号と同じではない。

Oxygen can give a positive bias in such a system, meaning measurements are skewed higher, limiting the accuracy at low glucose values.
酸素はこういった系では正のバイアスを与え、測定値は高い方へ傾き、グルコース量が低い場合の精度を制限する。
（この文章はちょっとわかりません。グラフを見ても酸素は負のバイアスを与えると思うのですが。）

さらに"producing a signal that is related to glucose, but not in the same way as the ferricyanide-mediated signal"との部分がわからないので調べてみたところ、Anal. Chem. 誌に次のような説明がありました。（ただし、酸化剤はフェロセンを使っています。フェリシアン化物の論文はClin. Chim. Actaにあるらしいのですが、図書館にこの雑誌がないので）

While some interference from oxygen is expected, the current decrease occurs as the base electrode was not poised sufficiently positive to reoxidize any hydrogen peroxide generated by the enzymatic reaction, eq 1.
酸素による何らかの影響が考えられるが、電流の減少は、酵素反応で生じた過酸化水素を再酸化するのに充分なほどベース電極の電位が高くない場合に起こる。
（nemuinemuiさんの「酸化電位が高くなる」というのはこのことを指していると思います）

まとめると、

・酸素の影響は
グルコース + O2 → グルコノラクトン + H2O2
の反応によるもの
・もし過酸化水素もフェロシアン化物と同じく電極で酸化されたとすると測定値には影響がないが、過酸化水素を酸化するほど高い電位をかけると血中の代謝物の影響が大きくなるため、できない。
・よってフェロシアン化物だけが電極で酸化され、酸素による酸化の分だけ、測定値は低くなる。

MiJunさんご指摘の血中酸素量ですが、血糖は通常4～8mmol/L、動脈血の酸素が0.15mmol/Lということなので2～4％の誤差でしょうか…？

rei00さんのお書きになったフェリシアン化物－フェロシアン化物の標準電極電位ですが、もしフェロシアン化物が空気酸化を受けにくいとしたら、速度論的な問題かもしれないですね（熱力学的には不安定でも）。（「コットン・ウィルキンソン　無機化学」の鉄(II)の空気酸化に関する記述で思いつきました。この点に関しては千谷利三「新版　無機化学」の記述はあまり正確ではないかもしれなかったですね。すみません。）

（コットン・ウィルキンソン初めて見てみました。訳本は敬遠していたんですが、rei00さんのおっしゃるようにわかりやすいですね。私の知識は高校時代の「新版　無機化学」で止まっているので、これで勉強しなくては…）

参考文献
"Biosensors: Blockbuster or Bomb? -Electrochemical Biosensors for Diabetes Monitoring"
L. S. Kuhn, Interface, pp. 26-31, Winter 1998.
http://www.electrochem.org/publications/interface/winter98/IF12-98-Pages26-31.pdf

"Ferrocene-Mediated Enzyme Electrode for Amperometric Determination of Glucose"
A. E. G. Cass et al., Anal. Chem., 56, pp. 667-671, 1984.

参考URL：

http://www.electrochem.org/publications/interface/winter98/winter98.htm

回答No.10

rei00

rei00 です。
もう皆さんお忘れかも知れませんが，「後はグルコ－スの還元電位が必要ですね（明日図書館へ行ってみます）。」と言った（書いた）手前，若干の補足です。

　で，グルコ－スの還元電位ですが，幾つかの成書を探してはみたんですがわかりませんでした（スミマセン）。ただ，私の印象では，グルコ－スは大部分がピラン環を巻いているはずですから，そんなに簡単に酸化されないように思います。

　一方，先に書いたフェロシアン化鉄の酸化ですが，anisol さんの指摘もあり，また，「コットン・ウィルキンソン　無機化学」（倍風館）にも私が思っていた程酸化されないような記載がありますので，考えにくいと思われます。

　後残るのは，nemuinemui さんがお書きの『溶存酸素が多い状態にあると「酸化電位が高くなる」』です。これがどういう意味か少し考えてみたのですが，電気化学が苦手な私ですので，よくわかりません。ただ，通常の電気分解の場合も電極表面に気体が付いて効率が落ちるはずです。で酸素分圧が高い場合，これと同じ様な理由でフェロシアン化鉄の酸化が進みにくくなるのではと考えたのですが・・・・，いかがでしょうか。

anisol さん
> 以前フェロシアン化カリウムの再結晶をやったことがあり
　じゃ，立派な経験者じゃないですか。私はそんな経験もないですし，この手の分野（電気化学，無機化学，錯体化学？）は全くの苦手分野です。ですので，全くの素人。

> どちらかといえば古典的、記述的無機化学の教科書なので
> （あまり理論的ではない）、専門家の方にはあまり好まれない
> と思っていました。
　私，先に書いた通り，この本を所有していましたが，大学時分に行方不明になりました。で，その後類似の本（古典的、記述的無機化学の教科書）を探したのですが見付からず，比較的近いものとして上記の「コットン・ウィルキンソン　無機化学」を購入した経緯があります。我々のような，無機化学を専門としない者にとっては，記述的なものの方が役立つんですが，最近ないですね。

回答No.9

noname#211914

MiJunです。

手元にGODに関する成書がないのでネット検索で少し調べてみました。

この測定器で使用されているGODの由来が問題ですが・・・？

「グルコン酸」生成に関連する酵素は
1.Aspergillus Niger等
2.Gluconobacter等
があるようです。
=====================================
１での反応は
・グルコース+O2→グルコノラクトン+H2O2
(H2O2→H2O+1/2O2:カタラーゼ)
・グルコノラクトン+H2O→グルコン酸：グルコノラクトナーゼ
（酵素の関与がなくとも自然発生的に生成；別ルート）
⇒Totalの反応
・グルコース＋1/2O2→グルコン酸

２での反応
・グルコース⇒グルコン酸：２種のグルコースデヒドロゲナーゼ（H2O2の発生なし！）
=====================================
ここからは推測ですが、GOD法とのことですから、恐らく１の細菌由来の酵素を用いているのではないでしょうか・・・？

さらに、問題は使用されている酵素（複合体？）がGOD/カタラーゼであるかです？
それによってTotalの反応式が少し変わってきます（自信なし）？

次に、実際の測定器の検出限界の上限の情報がありませんが、仮に200mg/dlとしてこれはGlu濃度で1.11ｘ10＾-2（M）です。勿論、測定に必要な血液量はμl単位でしょうから、Gluの絶対量としては僅かですね。従って、酸素量も僅か・・・？

もし、酸素が影響されるとすれば、GODがHb（ヘモグロビン）のように酸素に対してシグモイド曲線を描くとか・・・？
あるいはConformation変化を起こすとか・・・・？

勘違いしている点をご指摘下さい。

お礼

質問者です。
ぼーっとしている間に素晴らしいご見解の数々を頂いて
ありがとうございました。
すごい内容に付いていけない部分もたくさんあって
ただただ恐縮です。お返事するのが怖いです。

私なりの（かなり感覚的なのですが）考えは、
No.５のご回答に近いのですが、
まず調べたことから…。

ＧＯＤを用いた血糖測定器には、
臨床検査薬（フェリシアンイオン（Ｆｅ(3)））が
含まれていて、
フェロシアン（Ｆｅ(2)）は含まれていないらしいのです。

検体とする血液量は３～10μｌくらいが主流の様で、
グルコースがGODによって酸化する際、

グルコースに対して
Ｏ２　と、フェリシアン（Ｆｅ(3)）とがそれぞれ反応に介入して
１．グルコースは酸化され、グルコン酸（またはグルコノδラクトン？）に。
２．フェリシアンはフェロシアン（Ｆｅ(2)）に還元され、
　その後
３．フェロシアン（Ｆｅ(2)）→フェリシアン（Ｆｅ(3)）
　に酸化されるとき発生する電子ｅ－から電流量測定し、血糖値に換算する
…と、大まかなプロセスはこんなかんじらしいです。

私も、酸素もフェリシアンＦｅ（３）と同様、グルコースを酸化させる
役割を持っているのですから、
ある意味「競合」的な立場だから
酸素が多いと、
よりフェリシアンが反応する分が少なくなってしまって
結果フェロシアンＦｅ(2)→フェリシアン(3)
になるとき発生するｅ－量が減ってしまって
換算される血糖測定値が低く出てしまうのではないか、
と思いました。

でもなんだかまだ不安で、
ネット等で色々と調べたところ、
溶存酸素が多い状態にあると
「酸化電位が高くなる」というＨＰがありました。
（ゴメンナサイ！アドレス控えてません！）
溶存酸素が多い状態であると、
ポテンシャルがＦｅ(3)の方が高くなってしまって
Ｆｅ(2)（ポテンシャル低）→Ｆｅ(3)（ポテンシャル高）
この反応が進むのが大変になってしまって、
この反応によって生まれるｅ－量も少なくなってしまうのでは…？
とも思いました。

まだこんがらがっていて
稚拙な説明で申し訳ありません！
ご指導の程　宜しくお願い致します。

追伸
私は薬学部卒ですが、もう「ポテンシャル」なんて
言葉も久しぶりだな～っなんてレベルです。
おはずかしいかぎりです。

回答No.8

anisol

いや、別に細かい議論とかではなくて、こんな考え方はできないかな、と思っただけなのですが、すみません。「細かいことを突っ込みたがる人」に見えるんでしょうかね…（反省）。

以前フェロシアン化カリウムの再結晶をやったことがあり（ですから一部経験者ですが、専門家のrei00さんが一般人と書かれると「どんな人：ど素人」とかの選択肢が必要になって困ります（笑））、そのときには空気酸化されるようには見えなかったのですが、今考えるとフェリシアン化物イオンの水溶液も黄色っぽいので、気づかなかっただけかもしれません。

私の考えたのはGOD存在下の　グルコース + O2 + H2O → グルコン酸 + H2O2　の式です（何かひどい勘違いをしている気も）。

（「新版　無機化学」は初版昭和35年、昭和46年増補のものです。私は大好きな本ですが、rei00さんも良い本と思われますか、感動です。どちらかといえば古典的、記述的無機化学の教科書なので（あまり理論的ではない）、専門家の方にはあまり好まれないと思っていました。私も高校生の時図書室でこればかり読んでました）

回答No.7

rei00

rei00 です。anisol さん（「本当の一般人」って事はないでしょう。経験者でも良いのでは？）の突っ込みが来ましたので，慌てて調べてみました。といっても，ホントのところは解らないんですが。

　それぞれの還元電位を調べてみました（「アトキンス　物理化学　第６版」の値です）。

　[Fe(CN)6](3-) + e(-) → [Fe(CN)6](4-)　　+0.36 V
　Fe(3+) + e(-) → Fe(2+)　　+0.77 V
　O2 + 2H2O + 4e(-) → 4OH(-)　　+0.40 V
　O2 + 4H(+) + 4e(-) → 2H2O　　+1.23 V
　O2 + e(-) → O2(-)　　-0.56 V
　O2 + H2O + 2e(-) → HO2(-) + OH(-)　　-0.08 V

　これで考えると，確かに [Fe(CN)6](4-) の酸素酸化は通常の鉄（II）イオンよりも起こりにくいようですね。ただ，標準電位は＋になるようですので（O2- や HO2- が出来る反応は起こりにくいと思いますので），起こらないとも言えないようです（どの程度起こるかは解りませんが）。後はグルコ－スの還元電位が必要ですね（明日図書館へ行ってみます）。

　ところで，「新版　無機化学」（千谷利三著、産業図書、昭和54年）ですが，出版は昭和５４年ですか・・・。私，この本を高校生の時に買った記憶があるのですが，それだともっと前になるんですが。それとも，あれは「新版」ではなかったのでしょうかね？どちらにしても，良い本ですよね。何処かへ行ってしまって手元に無いのが惜しまれます。

　と，今見ると MiJun さんのコメントが。確かに，錯体の専門家の方にお出で願いたいですね。

回答No.6

noname#211914

MiJunです。
anisolさんの回答で
>血中の酸素によっても酸化を受けるので
どのような反応式と想定されていいるのでしょうか・・・？

細かい議論（？）になってついて行けそうにありませんが・・・？

実際に測定する場合を考えると、採血あるいは指等に針で出血させてそれをチップ状の端子に接触させて測定すると思います。
anisolさんの血中酸素（濃度）は、大気中の酸素と平衡状態にあるのですよね・・・？
（この部分は無視して頂いた方が良いのかもしれませんが・・・）

いずれにしても、先の回答でrei00さんも指摘しているように、酵素反応でも酸素の影響は考慮しなくてもよいのではないでしょうか・・・？

ですから、どのような酵素反応過程でも反応式は・・・？

さらに後半のフェロシアン化錯体（この名称が良いのか？）の酸化・還元に関しては、錯体の反応機構専門家のコメントがあれば嬉しいのですが・・・？

補足お願いします。

回答No.5

anisol

こんにちは。

rei00さんの説明で、 [Fe(CN)6](4-) が空気酸化を起こすという点が気になったので、私は本当の一般人ですが、次のような説明はできないでしょうか。

「グルコ－スオキシダ－ゼの存在の下、グルコースは[Fe(CN)6](3-)で酸化されるほか、血中の酸素によっても酸化を受けるので、その分消費される[Fe(CN)6](3-)は少なくなり、[Fe(CN)6](4-)の生成量も少なくなるのでグルコースは低めに定量される。」

私の（当てにならない）感覚では、フェロシアン化物イオンは空気酸化は受けにくく、安定と思います。また、一般的には2価の鉄イオンは不安定といわれていますが、「新版　無機化学」（千谷利三著、産業図書、昭和54年）には「第一鉄塩の方が本質的に安定」であって、2価の鉄塩が不安定に見えるのは、鉄(II)塩の加水分解で生じる水酸化鉄(III)の溶解度が極めて小さい結果、としてあります。

毎度突っ込み回答が多くてすみません。間違い、勘違い等ご指摘お願いします。

回答No.4

rei00

rei00 です。

>（天邪鬼であまり全てを書きたくなかったので・・・。
> さらに質問者にも考えて欲しい物ですから・・・）
　いや，基本的には私もそうです。先の回答の際にも，MiJun さんの意図は充分わかっていました（最初は，私も同様の回答を入れようかと考えていたぐらいです）。ただ，指摘する以上はその根拠を示さなければ，と考えている間に詳しくなりすぎたかも知れません（少し反省してます）。

> 生成物で「Ｄ-グルコノ-δ-ラクトン 」と「グルコン酸」
> の違いがあります・・・？
　そうなんです。やっぱり指摘されましたね。私もよくわからないものですので，「生化学辞典　第３版」（東京化学同人）の記載をそのまま書いたのですが，説明不足ですね。

　手元の「レ－ニンジャ－の新生化学　第２版」によると，Ｄ-グルコネ－ト（グルコン酸アニオン）が出来るように書いてあります。

　酵素反応の生成物がどちらなのか，あるいは酵素の起源によって異なるのか，よく判りません。が「グルコ－スデヒドロゲナ－ゼ」の項に，『グルコノラクトンは非酵素的にグルコン酸になる』との記述がありますので，実際にはグルコン酸が生じていると思われます。

回答No.3

noname#211914

MiJunです。
rei00さん、ご指摘有難うございます。
いつも通りミスタイプと言うか言葉足らずで失礼しました。
酵素反応ではなく、その後の反応が関与しているという意味でのヒントとして書いたのですが、誤解を生んだようです（天邪鬼であまり全てを書きたくなかったので・・・。さらに質問者にも考えて欲しい物ですから・・・）？

rei00さんの式（1）と参考ＵＲＬサイトのＧＯＤ法を比較すると、生成物で「Ｄ-グルコノ-δ-ラクトン 」と「グルコン酸」の違いがあります・・・？

後半部分はrei00さんと同様に考えてます。

回答No.2

rei00

MiJun さんの回答がありますが，チョット気になったので，もう少し詳しく回答します。

MiJun さん
> Fe(III)⇒Fe(II)
> の過程を考えて下さい。
　私も自身はないですが，Fe(II) ⇒ Fe(III)　のタイプミスじゃないでしょうか。私は以下の様に考えたんですが，そうすると，Fe(II) ⇒ Fe(III)　でないと合わないんですが。私の勘違いでしょうか。

　「生化学辞典　第３版」（東京化学同人）によると，グルコ－スオキシダ－ゼ（GOD）は次の反応を行ないます。
　β-Ｄ-グルコ－ス + H2O + FAD + (1/2)O2 → Ｄ-グルコノ-δ-ラクトン + H2O2 + FADH2

　この事と MiJun さんお示しのペ－ジの記載からすると，上式の酸化剤［H2O + FAD + (1/2)O2］の代わりをフェリシアン化カリウム［K3Fe(CN)6］が行なっていると考えられます。つまり，MiJun さんお示しのペ－ジの次の式ですね。
　β-Ｄ-グルコ－ス + 2[Fe(CN)6](3-) → Ｄ-グルコノ-δ-ラクトン + 2[Fe(CN)6](4-)　（式１）

　この段階では酸素は反応に関与していませんので，酸素分圧の影響は出てきません。

　次に，MiJun さんのペ－ジの記載によると，生じたフェロシアン化カリウムに電位をかけてフェリシアン化カリウムにする（酸化する）際に生じる電子を電流として測定している様です。反応式としては，次のものになります。
　[Fe(CN)6](4-) → [Fe(CN)6](3-) + e(-)　（式２）

　ここで生じる電流の大きさは，上の反応で生じる電子の量によります。つまり，[Fe(CN)6](4-) の量により，この量は（式１）からβ-Ｄ-グルコ－ス量（血液中のブドウ糖濃度）に比例します。

　ところで，鉄イオンは２価よりも３価の状態の方が安定であるため，空中の酸素などで容易に３価に酸化されます。つまり，溶存酸素が多くあると，空気酸化が起こる分だけ（式２）の反応を起こす [Fe(CN)6](4-) の量が少なくなり，電流値（測定値）が低くなります。

　いかがでしょうか。「生化学辞典　第３版」と MiJun さんのペ－ジの記載に基づく私の推測です（ですので，アドバイスで自信なし）。間違っているようでしたら，ご指摘やお叱り，よろしくお願いします。

回答No.1

noname#211914

以下の参考URLサイトは参考になりますでしょうか？
「血糖自己測定器について」
この中で「グルコースオキシダーゼ（GOD）法」ですね？

Fe(III)⇒Fe(II)
の過程を考えて下さい。

ご参考まで。

参考URL：

http://square.umin.ac.jp/~jin/text/BS.html