50%阻害濃度について

質問

こんにちわ。初めて投稿します。
　バイオ関係の論文(gene deliveryについて)を読んでいるのですが、IC50という言葉が出てきました。luciferase遺伝子をもつプラスミドをデリバリーポリマーに内包させ、BHK-21というセルに加えたという話なのですが、MTT(?)という物質を加えて生育状況を見た、と書いてあります。
　私は化学初心者でバイオにも疎く、このIC50の意味がわかりません。化学大辞典なども調べましたが、見当たりませんでした。何が50%で、何が阻害されるのか教えてください。できれば、MTT assayについても教えていただければ幸いです。

回答No.4

noname#211914 · ベストアンサー

MiJunです。
やはり、ポリマーを添加して培養しているのですね？

対照は「untransfected cells」のようですね？

>セルにプラスミドを添加して一定時間放置した後、MTTアッセイによりセルの数を定量した、ということなのでしょうか？

Original paperを見てないのとプラスミドのtransfectの手法が分からないので推測ですが・・・・。
恐らくtransfectする際に各種のポリマー添加した場合に、添加ポリマーの毒性（？）(あるいはtransfectの手法？）で死滅する細胞があるのでしょう・・・？

その死滅細胞（残存細胞：cell survival）を見ていると思います。その残存細胞の割合をMTT assayで評価しているのではないでしょうか・・・？

補足お願いします。

補足

対照はtrancefectされていないセルのようです。
また、cell survivalですが、こちらの方はpolyplex(polymer+pDNA)をcellに添加し、48時間放置後total cellular proteinの量を見ているらいしのです。
これについてもやはり細かいことがわからなくてLowry protein asseyで行ったということです。このLowry protein asseyとはいったいどんなものなのでしょうか。
おそらくタンパクの量で細胞が減った量を知ることができるのだと思うのですが。

MiJunさんはどのように思われますか?

度々の質問すみません。

回答No.3

noname#211914

MiJunです。
PaperのAbst.見つけました。
「Effects of structure of beta-cyclodextrin-containing polymers on gene delivery.」
ですね？

「Materials and Methods」を見ないと詳細は分かりませんが、以下推測です。

「betaCDP4, 5, 6, 7, 8, and 10」の各polymerをin vitroで添加した際のtoxicityを見ているのではないでしょうか？
⇒各polymerの添加濃度（あるいはIC50）（Ｙ軸）と各polymer（Ｘ軸）の関連のFigureあるいはTableは論文中にないでしょうか？

「Materials and Methods」の中の「in vitro assay」あるいは「toxicity」のような記載はないでしょうか？
あればその部分のみを補足にコピーしてください。

補足お願いします。

補足

アブストまで見てもらってほんと助かります。
私もなんとなくわかってきましたが、参考までに示された部分をコピーしときます。
IC50 Determination. BHK-21 cells were plated at 5000 cells/0.1 mL/well in 96 well plates and incubated at 37 C for 24 h. CDPs (16 mg/mL in complete media) were then added to the third column of cells and diluted serially across the rows. The cells were incubated with the polymers for 24 h at 37 C. The media was then removed from the cells and cells were washed once with PBS. Fifty microliters of MTT (2 mg/mL in PBS) was added to each well followed by 150 L of complete media. The cells were incubated for an additional 24 h before the media was removed and blue formazan crystals formed were dissolved in 150 L of DMSO. The absorbances were read at 562 nm in a microplate reader (EL-312e Biokinetics Reader, Biotek Instruments, Winooski, VT).

ちなみに、各ポリマーに対するIC50のFigはあります。
他にも、【Cell Survival】を各ポリマーに対してプロットしたFigもあります。
この、【Cell Survival】の説明は次のようにされています。

Cell survival was calculated by dividing cellular protein levels of transfected cells by untransfected cells.

これも、セルにプラスミドを添加して一定時間放置した後、MTTアッセイによりセルの数を定量した、ということなのでしょうか？

回答No.2

noname#211914

自信がありませんが、「BHK21細胞」に関しては以下の参考ＵＲＬサイトは参考になりますでしょうか？

BHK21:ハムスター腎由来細胞

「MTT アッセイ」に関しては以下のサイトは参考になりますでしょうか？
●http://www.dojindo.co.jp/wwwroot/whatsnewsj/newpro/cck8/mtt.html
「MTT」は「3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide」の略記です。

「IC50」はBHK21細胞の増殖を対照群に対して、50％阻害する濃度です。
⇒この場合は対照はプラスミドを入れていないBHK21でしょうか・・・？

原文がPubMedでAbst.が見られるかもしれませんので、文献を教えて下さい。

補足お願いします。

参考URL：

http://group.lin.go.jp/nichiju/mag/05305/01_06.htm

補足

文献は
　Bioconjugate Chem., 12, 280. (2001)
です。

IC50の対照はおそらくプラスミドを入れていないセルだと思うのですが。
今ちょっとわからなくなったのですが、50%とはセルの数が半分になるという認識でよいのでしょうか?

回答No.1

rei00

> このIC50の意味がわかりません。

　IC とは Inhibitory Concentration の事で，50 は 50% の意味で，IC50 とは「50% 阻害濃度」です。つまり，今問題にしているアッセイ系で 50% の効果を与える濃度です。

> 何が50%で、何が阻害されるのか教えてください。

　これは，どの様な実験をしているかで変わります。お書きの実験が良くわからないので，間違っているかも知れませんが，「luciferase 遺伝子をもつプラスミド」を導入することで細胞が死ぬのでしょうか。そうであれば，次の様な事が考えられます。

　コントロ－ル（溶媒あるいは luciferase 遺伝子だけをデリバリ－ポリマ－に内包して加えた実験）の MTT アッセイ結果（細胞はあまり死なない）を 100% とします。これに対して，「luciferase 遺伝子をもつプラスミド」を幾つかの濃度で導入し，それぞれの細胞生存率（コントロ－ルの数値に対する％）を求めます。これをlog[濃度] に対してプロットし，生存率が 50% になる濃度を求めます。この濃度が IC50 です。

> MTT assayについても教えていただければ幸いです。

　MTT アッセイについては以前に回答した事があります（QNo.98392　MTT法）ので，そちらをご覧下さい（↓）。

参考URL：

http://www.okweb.ne.jp/kotaeru.php3?q=98392

お礼

おそらく細胞にプラスミドを導入することで細胞が死ぬんだと思います。納得しました。
MTT法についてもたいへん勉強になりました。
検索かけずに質問したこと、お詫びします。
ありがとうございました。