- 締切済み
教えて下さい。
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
みんなの回答
- hebikera
- ベストアンサー率33% (48/142)
DEPC処理水は多少臭いが残っていても大した影響はないと思います。 どうしても気になるのでしたら、もう1度オートクレーブにかける程度で 充分だと思いますが。 また、ファーストストランドの合成に関して、カタログでは45度、30分で 3.5kbまで増幅可能だとかいてますよね。 どれくらいの長さが必要なのかわかりませんが、3.5kbでは短い、または 念のためもっと長く合成するようにしたいということでしたら、同じくGIBCO のエンゲロース酵素ミックスを併用することで9kbまで増幅できるように なるようですので、そちらをご利用になってはいかがでしょうか?
関連するQ&A
- 市販のDEPC処理水の安全性
はじめて質問させていただきます。某大学院にはいってRNA実験を始めたところです。RNase処理のためDEPC(Dietyl Pyrocarbonate)が必要でしたが、実験の性質上、DEPC処理水を購入すればいいことになったため、某社より、高圧蒸気滅菌処理されたDEPC処理水を買いました。既製品のため、ドラフトを使用せず、ふつうのテーブルで実験していました。手袋・マスクをしていましたが、臭いがしてきて少し気分が悪くなりましたが50～60分くらい実験してました。DEPCに発ガン性があるとのことで不安になりました。ドラフトを使用するようにいろんなweb siteに書いてあります。少し長くなりましたが、 質問は(1)オートクレーブした蒸気を吸ったわけではありませんが今回の実験は人体に危なかったでしょうか？(2)DEPCは強い臭いが有名ですが、常温でも揮発性なんでしょうか？ よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- ＲＮＡ実験について
生物実験を行う上で全く知識が追い付いてないので質問させてください TotalRNAを得る過程です。 1.DEPC水とかはオートクレーブするわけですが、普通に開けてしまっていいのでしょうか？つまり、 クリーンベンチなどの無菌的な環境で使用しなくてもよいのでしょうか？（PBSとかも） 2.キットとかにサンプルの上限量とか書かれていますが、そもそもサンプルの量ってどうやって測ればよいのでしょうか？対数増殖期の微生物を集菌して、洗浄して、1.5ｍｌのチューブに0.5ｍｌ分注しているのですが、ペレットとして得られる量はまばらですし・・・。あらかじめ分注しておくチューブの重さを測定して・・・なんて面倒なことはしませんよね？ 3.得られたRNAを吸光光度計で精度を確認したいのですが細かな操作がわかりません。そもそもRNAの量ってどうやってわかるのでしょうか？ また、測定する際、得られた沈殿（エタ沈したもの）を50μｌのｍｉｌｌｉＱに懸濁させてさらに50倍に薄めて測定とかだとダメでしょうか？ 4．上で得た懸濁液って保存が効くのでしょうか？それともエタ沈状態で凍結保存でしょうか？そうなると吸光度測定とか出来ない・・・うーん、わからないです＞＜サンプルをちょっとだけ取るとか出来ませんよね？ 文章力もなくて恐縮ですが、よろしくお願いします
- ベストアンサー
- 生物学
- pGEX-6p-1の形質転換
GEヘルスケアのベクターを使ったライゲーションとトランスフォーメーションがうまくいきません。以下に実験の概要を書きますので、どこに原因があるのか分かる方、アドバイスよろしくお願いいたします。 Total RNA抽出 ↓ cDNA合成 ↓ 目的遺伝子の部分配列(1521bp)プライマーでPCR ↓ 5'(Foward)末端にBamH1配列、3'(Reverse) 末端にStop Codon 配列を組み込んだプライマーで上記のPCR産物をテンプレとして再びPCR ↓ ゲル抽出 ↓ ライゲーション(p-GEM-T-easy Vector Systems, Promega)とトランスフォーメーション（大腸菌はDH5α） ↓ コロニーPCR(M13プライマー)でインサートチェック ↓ プラスミド抽出 ↓ シークエンス解析（全配列は読めなかったが、BamH1、Stop Codon配列は確認） ↓ 制限酵素処理(BamH1、EcoR1)、同時にpGEX-6p-1ベクターも同じ制限酵素処理 ↓ ゲル抽出 ↓ ライゲーションとトランスフォーメーション（大腸菌はBL21、GEから購入し、自分で培養） ↓ コロニーPCR(pGEX sequencing Primer使用、ただし、経費節減のため、GEのものではなく、Operonに作ってもらった) ↓ なぜか、160bpくらいにバンドが出た pGEXのライゲーションにはp-GEM-T-easy Vector Systems(Promega)を流用しています。 BL21には空ベクター(pGEX)が導入されることはコロニーPCRで確認しています。 後、制限酵素処理したベクターに脱リン酸化処理などもしてみましたが、結果は同じでした。 ですので、おそらくライゲーションがうまくいってないのでは、と思います。しかし、どうすればよいか分からないため、困っております。長文ですいませんがよろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
ありがとうございました。 参考になりました。