ドデシル硫酸ナトリウムによる付着蛋白質の剥離実験をしているんですが・・・

質問

ドデシル硫酸ナトリウムによる付着蛋白質の剥離実験をしています、１％３％５％１０％で系日的に蛋白質量を調べています。そこで質問なんですが「１％の結果は吸光度が初日0.057、３日目0.068」「３％の結果が初日0.217、３日目0.232」「５％の結果が初日0.294、３日目0.304」「１０％の結果が初日0.284、３日目0.285」でした。この結果から出た疑問なんですが、なぜ５％の方が良く蛋白質が良く剥がれ１０％の方があまり剥がれていないのでしょうか？知識をお持ちの方、又はアドバイスでもぜんぜん結構なんでお返事お待ちしております。

回答No.2

hiroU · ベストアンサー

まず、質問にあった測定値は１回測定した結果ですか？基本的に、１回のみの測定で結論を導くことは信頼性にかけると思います。これは、既に解答している方々が述べているように、誤差に関わる問題です。
つぎに、タンパク質の定量法による問題が考えられます。定量法にはいろいろあって、界面活性剤が含まれた溶液での測定に適していないものもあります。
最後に、５％ですでに全てのタンパク質が剥離し、１０％でももうそれ以上は剥離するタンパク質がないので、５％と同程度の値になってしまったことが考えられます。
以上、参考になれば幸いです。

補足

お返事ありがとうございます。
１回測定した結果ですか？>>
１回だけの測定ですので信頼性に欠けるのはおっしゃる通りだと思います、検体数をこなすように改善していきます。
タンパク質の定量法による問題＞＞
ＢＣＡ法を用いています、この方法だと界面活性剤の影響は受けないはずなので問題は無いと思います。

あと補足で質問をさせていただきたいのですがもし、何かの有機溶媒に蛋白質が付着している物を完全に溶かしてしまって蛋白質を測定したらどうなるでしょうか？蛋白質も変性してしまって定量出来なくなるんでしょうか・・・。５％の界面活性剤で蛋白質を剥がし終わった物に発色試薬をかけてみたんですが思い切り色が変わってしまいまだまだ蛋白質が剥がれていないのが分かってしまいました・・・。ご意見をできればいただきたいです。あつかましい質問大変失礼だと思いますがよろしくお願いします。

回答No.3

hiroU

補足の質問に対してお答えします。
まず、BCA法は確かに界面活性剤の影響を受けにくい方法として知られており、一般的なタンパク質定量法になっています。しかし、それは「受けにくい」だけであって、「受けない」訳ではありません。お使いのBCA法の説明書を調べてみてください。そこには、界面活性剤の影響を受けない濃度が記されていると思います。私の記憶が正しければ、確かドテシル硫酸ナトリウムは５％が限界だったように思います。したがって、今回のように５％までのデータは信用できそうで、１０％のデータは怪しいという結果が生じた可能性が考えられます。
つぎに、有機溶媒により変性させると定量できないのでは？という御質問に対してお答えします。これに関しても、影響を受けやすい有機溶媒と受けにくい有機溶媒の説明が濃度とともに記述されているはずです。代表的な有機溶媒であるメタノール、アセトン、エタノールは１０％くらいまで大丈夫だったように思います。そもそもドテシル硫酸ナトリウムは有機溶媒よりも強い非常に強力なタンパク質変性剤です。したがって、変性してしまったから定量できないという可能性は低いとおもいます。
実験頑張って下さい！！

お礼

解説書や資料を探して読んでみたところ、ＢＣＡ法に関してもＳＤＳに関してもhiroＵさんのおっしゃるように書かれてありました。実験がんばります！ありがとうございました！

回答No.1

Dr_Hyper

付着蛋白質の剥離実験というのをやったことがないので無責任な返答ですが、
界面活性剤で剥離するタンパク質を定量していると考えて実験の誤差についてご参考になればと思い書きます。
はじめに気になるのは、　5%と10%の間の吸光度 の違いは誤差の範囲ではなく有意に差があると考えられるのですか？
　もしこの測定値がいくつかのサンプルを測定しちゃんと誤差範囲もわかっているとすれば、次に気になるのが、この実験での吸着タンパク質は剥離前にどの容器にも同じように吸着しているの？という実験の前提になる所の誤差です。実際にそのぶれはどのように補正しているのでしょうか？
なぜそのように思うかと言うと、データーの5%は初日と３日目で吸光度に0.304-0.294=0.1の差があります。つまり日数を於いた方がさらに溶出してくるということですね。
一方、10%のほうは、0.285-0.284=0.01で他のサンプルに比べて著しく吸光度の増加が低いように見えます。
つまり、初日だけで吸着したタンパク質の大部分を剥離するのに、十分な界面活性剤が加えられ、タンパク質がこの吸光度で検出されている量以上にこの容器？では吸着して無かったことを意味しているのではないですか？
どのような考察をされるかでこの実験の評価はかわってくると思いますが、洗浄に必要最小限の界面活性剤という観点の他に、つけ置き洗いの意義という観点からみると、初日と３日目の吸光度の増加量も考察した方がいいのではないですか？

補足

お返事おそくなってすいません！
>>5%と10%の間の吸光度 の違いは誤差の範囲ではなく有意に差があると考えられるのですか？
特に優位な差はではないと考えています。
>>吸着タンパク質は剥離前にどの容器にも同じように吸着しているの？補正は？
との事ですが量よりも蛋白質の日ごとの増加率を見たかったので、各容器の蛋白質量は考慮していません。「濃度を上げれば多く剥がれる」という理屈に合わない結果が出てしまったので質問させていただきました。
補足ですが４日たって５％の物が一番吸光度が上がりそれ以上変化しなくなったので「本当にぜんぶはがれたのか？」と思い蒸留水で５回洗浄した検体に蛋白測定用の発色液をかけてみたら思い切り色が変わってしまいました。ぜんぜん剥がれていなかったみたいです・・・。何かうまく蛋白質を剥がす方法ご存知ではないでしょうか？色々教えていただいた上にあつかましい質問までして本当に申し訳ございません。