Light cycler使用時のサンプル添加に関する疑問
- Light cycler使用時のサンプル添加についての疑問について解説します。
- マスターMixとテンプレートの添加順についての理由について説明します。
- 機器マニュアルと試薬のマニュアルには「最初から混ぜるな」と書かれていますが、その理由は不明です。
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Light cycler使用時のサンプル添加に関する疑問
SYBR Greenを用いてLight cyclerでリアルタイムPCRを行っています． キャピラリーにサンプルを添加する際，マスターMixを入れた後にテンプレートを加えるのはなぜでしょうか？ 最初（マニュアルをよく読まずに），テンプレートをマスターMixに加えてからキャピラリーに添加し，実験を行いました．しかしマニュアルを見ると別々に入れるようになっており，「最初から混ぜるな」とまで書いてあります． しかし，普通に考えたら，最初から混ぜておいた方が良いと思いますし，混ぜてから行っても結果に問題はありませんでした（と思いました）． 機器マニュアルにも試薬のマニュアルにも「最初から混ぜるな」と書いてありますが，どこを探しても理由がわかりませんでした． よろしくお願いします．
- takakokoreo
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質問者が選んだベストアンサー
ご使用の試薬は、どのメーカーのなんていうキットでしょう。 テンプレートを後から入れろというのは、一般的に考えると、常温での非特異的な増幅を避けるためでは無いでしょうか。 ただし、多くのキットは、常温でのTaq polymeraseの活性を押さえる工夫（抗体等によって）がしてあって、最初のサイクルの前に、熱による活性化をしてからPCRサイクルを初める様になっている（ホットスタート）ものが多いようです。 キャピラリでのリアルタイムPCRの経験は無いのですが、ホットスタートするようにはできていないのでしょうか？
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お礼
ありがとうございます． 試薬は，QIAGENのQuantiTect SYBR Green PCR Kitを使っています． 質問文に書き忘れていましたが，このキットはHotStarTaq DNA Polymeraseを用いています． にも関わらず，テンプレートを最初に混ぜるなと書いてあります．混ぜておいた方がピペッティング誤差が少ないし，簡単だし，早く終わるのに・・・． 素直にマニュアルどおりやれば良いだけなのかもしれませんが，楽したい性質なので・・・・． ありがとうございました．