- ベストアンサー
TaqManプローブを用いたPCRについて
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
- ベストアンサー
以下の参考URLは参考になりますでしょうか?
関連するQ&A
- プライマーダイマーが出てしまいます。
PCRがうまくいきません。プライマーダイマーが出てしまいます。 鋳型DNAが少ないとできやすいと聞いた事があるのですが、鋳型はあまり たくさんないので、増やす事もままなりません。 他に何か良い方法があったら教えて下さい。 Taqポリメラーゼを使っています。Hot Startしてもダメでした。 例えば、プライマーを減らしたりするのは有効でしょうか？？
- ベストアンサー
- 生物学
- in situ probeの作り方
in situ 用のRNA probe作製についての質問です。 現在行っているprobe作製の手順ですが、 (1)SP6およびT7の配列を組み込んだPCR primerを使って、目的の配列とpolymeraseの配列を含んだPCR産物を得ます。 (2)このPCR産物をin vitro transcriptionのtempleteとして用い、RNAを合成します。 (3)RNA columnにより精製し、最後にgel上でバンドの確認をします。 この最後のgel上での確認の際、バンドが2本見えます。1本は目的のサイズです。スメアではないのでRNAが分解したものではないと思います。 DNAのコンタミかと考え、in vitro transcriptionの試薬を新しくし、再試行しましたが、同じ結果となりました。 どのようにしたらこの問題を解消できるのでしょうか。 in vitro transcriptionの前にgel extractionによりPCR産物は精製しているので、全く異なる配列のRNA産物ではないと思うのですが、このままin situに使えますか？ もし、シグナルが得られても結果に自信が持てない気もしますが。。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- PCRのことについて質問なのですが、現在私が行っている細胞から、DNA
PCRのことについて質問なのですが、現在私が行っている細胞から、DNAを抽出しPCRを行うという実験で、うまくいかず行き詰っているので質問させていただきます。 現在以下の条件でPCRを行っているのですが、うまくいきません。 組成 forwardプライマー：1μL（=1pmol/μL） reverseプライマー：1μL（=1pmol/μL） Go Taq 5xBuffer：10μL dNTP：5μL(final濃度で200μM) Go Taq DNA polymerase：1μL 鋳型DNA：1μL MgCl2：3μL 滅菌水：28μL 計50μL 反応 ・反応 96℃：5分 ↓ 25サイクル 96℃：1分 55℃：1分 72℃：1分 ↓ 72℃：5分 ↓ 4℃： 設計ではPCR産物の長さは約100塩基ですが、これを行うと50塩基のPCR産物が検出され、100塩基のものはまったく確認することができませんでした。 また、プライマーの長さは約20塩基です。プライマーのTm設定はアニーリング温度を55℃と設定して、それよりも+5℃のTm値を持つよう設計しました。 同様の質問をyahoo知恵袋でも行いまして、回答してくださった皆様の条件でも行いましたが、いずれも同じ結果となってしまいました。 http://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question_detail/q1449649784 また、最近sigma社のXNATR REDExtract-N-AmpTM Tissue PCR Kitの組成液にプライマーと細胞抽出液を入れてPCRを行いましたが同じ結果でした。 原因、改良点の指摘がありましたら是非教えていだけますでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- 変異体構築PCRについて
pET11aベクターにキチナーゼの配列がインサートされているものを鋳型として、１ヶ所だけアミノ酸を変えた変異体構築を試みています。polymeraseはPfuUltra High-Fidelity DNA polymeraseを使用しています。しかし、プロトコールを元に反応系とサイクルを変えてPCRをかけていますが、電気泳動で確認してもバンドがでません。 構築できないと先に進まないため、困っています。 アドバイスお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- PCRで複数のバンドがでます。
初歩的な質問ですいません。 PCRをしています。PCR産物を電気泳動すると、複数のバンドがでます。なぜでしょうか？ たとえば、100、200、300塩基の長さのバンドがでるとすると、これらはすべて、用いたプライマーによって増幅されたものなのでしょうか？それとも、プライマーの配列と完全に一致しなくても、このようなバンドがでるのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- In situ real time PCRとは？
In situ real time PCRというものを論文で見つけたのですが、これはいったいどういう技術なのでしょうか？ In situ PCRで特異配列を増幅させてそれをプローブで検出するのならば分かりやすいのですが、どうしてそれとreal timeを組み合わせる事が出来るのでしょうか。 私はreal time PCRは遺伝子発現量を調べるためのものだと思っているのですが、それを組織切片で出来るということでしょうか？いまいち想像が出来ません。 どなたかご教授願えませんか？ （ちなみにその論文はアブストしか読めなかったので手技的なことは分かりませんでした）
- ベストアンサー
- 生物学
- RT-PCRにおけるプライマー設計について
はじめてお世話になります。 通常のPCR時におけるプライマー設計は理解できるのですが、RT-PCRにおいては、はじまりが1本鎖のcDNAであるということでひっかかりを感じます。 cDNAの塩基配列がわかっていますのでそれをもとに遺伝子解析系のソフトを用いてプライマーを設計したところ、sense-primerの配列が、ｃDNAの相補鎖となるものと相補的になっていました。（anti senseのほうはcDNAと相補的だったのですが） 実験書を読むとsenseがまずcDNAとアニールして2本鎖になってから通常のPCRがはじまるというふうに理解できましたので、上記のプライマー設計ではPCRがおこらないということでしょうか？ この場合はｃDNAの相補鎖に対してプライマー設計をおこなえばよいのでしょうか。 それともこのままのプライマーでよろしいのでしょうか？ よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- イノシン入りの縮重プライマーに適したPCR酵素は？
”はじめまして。Ｄ２の学生ですが、今年度より分子生物学関係の実験を始めました（これまでは生態学的なテーマが殆どでした）。うちの研究室自体が分子生物学をやり始めたばかりなので、初歩的な質問が多いかと思いますが、お答え頂ければ幸いです。また、誤った用語などありましたらご指摘ください” 【質問】 アミノ酸配列のみが分かっている遺伝子を釣ってくるために、縮重プライマーの設計を試みています。その際、Takaraのカタログを参考にしますと、イノシンが入っているprimerでPCRを行う際には、Ex Taqのような補正機能がついたTaq polymeraseを使うと増幅能が落ちるので、出来れば避けることと書いてありました。実際に使われている方々は、イノシン入りのdegenerate primerを用いる際にはどのような酵素を用いているのでしょうか。アドバイス下さい。ちなみに、増幅配列は500bp前後です。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
OHPを作製する参考にさせていただきました。 ありがとうございました。