- 締切済み
酵母（Saccharomyces cerevisiae）を用いた異種タンパク質発現について
rei00の回答
- rei00
- ベストアンサー率50% (1133/2260)
すみませんが，masa23 さんはお書きの様な実験の経験はどの程度お有りでしょうか。他の蛋白では問題なく発現されますか。 私自身は専門外ですが，知人に「H+,K+-ATPase」の研究を行なっている者がいます。彼の話などを聞いていると，お書きの実験は操作はそんなに難しくない（４年生の卒業研究でも行なえる）が，微妙なところにコツがいるようです。 先の回答者へのお礼の中で「論文では同じような条件で」とありますが，同じ条件だと思っているだけで，その微妙な違いが問題なのかも知れません。全く同じ条件ではやれないでしょうか。 もし，蛋白発現の経験があまりないのであれば，面倒でも一つ一つ確認して，どこに問題があるかを明らかにするのが，最初のステップだと思います。 まづ，cDNA はきちんと作れているか，組み込みは行われているか，mRNA はできているか，タンパクはできているか，等々を確認する必要があるでしょう。この辺は，ノ－ザンブロット，サザンブロット，ウエスタンブロット等で確認できると思います。 あまりお役に立たないかも知れませんが，ご参考まで。
noname#53364
noname#17364
- noname#17364
関連するQ&A
- 酵母のタンパク質 分泌・非分泌型の見分け方
全ゲノムの情報が公表されている酵母（Saccharomyces Cerevisiae)ですが、あるタンパク質が細胞外に分泌されるか否かはどうやったら判別可能でしょうか？？ タンパクのアミノ酸配列、塩基配列の情報はあるのですがそこから判断できますか？？
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパク質の一般的な発現量
各発現系の一般的な発現量を知りたいのです。 「一般的」というのは解釈に困る表現とわかっているのですが。 もちろん、発現させるタンパク質、培養条件などなどで 全然結果が違うのはわかります。 でも、それらを踏まえたうえでの「一般的」な発現量です。 参考にできる論文や書籍などありましたら教えてください。 一般的な発現量が知りたい発現系は ・大腸菌(E.coli) ・酵母(S.cerevisiae) ・酵母(P.pastoris) ・動物細胞 ・昆虫細胞 ・無細胞系（小麦胚由来） ・無細胞系(大腸菌由来) です。 例。大腸菌 数mg-20mgくらい とかで、よろしくお願いします。 もちろん、全ての発現系でなくても、幾つかわかる範囲でお願いします。 調べても、雰囲気はわかるのですが 一般的にだいたいどれくらいタンパク質が発現するかがわからなくって困ってます。
- 締切済み
- 生物学
- 酵母でタンパク質発現しなくなることはあるんですか？？
現在酵母（Pichia pastoris）を使って、タンパク質を発現しています。 １、２回目はクルードの状態で活性を検出できたのですが（精製後は活性が失われました…）、３回目以降で活性を検出することができなくなってしまいました。酵母を長期間保存（プレートで２週間程度）した以外は、全く条件を変えていません。 修論発表が迫っているのでかなり焦っています。 理由がわかる方いらっしゃいましたら、よろしくお願い致します。
- 締切済み
- 生物学
- 組換えタンパク質の発現について初めての質問です。
組換えタンパク質の発現について初めての質問です。 現在ある遺伝子を発現ベクターに組み込んでHisタグタンパク質の発現誘導条件の検討をおこなっています。以前同様の遺伝子でGSTタグを用いて組換えタンパク質を発現することができたことから、今回25、37℃での培養を行い(IPTGの終濃度1mM,0.5mM)、超音波処理による菌体破砕後、ゲル染色、ウエスタンで確認しましたが発現しているか確認することができませんでした。 羊土社の書籍を見ながら検討していることは、(1)培養温度をもう少し低くする(20℃)、(2)超音波処理の予備実験(今まで予備実験をおこなっていないのでタンパク質が失活・変性していると考え試薬による大腸破砕を検討中)、(3)プロテアーゼ阻害剤の使用 等を考えています。 その他にどのようなことを検討すればいいかアドバイスいただけませんか？よろしくお願いします。 ちなみに発現ベクターはpQEベクターで20-30kDa付近にバンドがでると予想しています。
- 締切済み
- 生物学
- 遺伝子組換えによるタンパク質発現
現在，タンパク質を遺伝子組換えにより，発現させたいと考えています．目的の遺伝子のORFの前に分泌シグナルを付加させ，分泌性タンパクを発現させたいと思います．宿主は酵母を用い，相同組換えにより発現させたいのですが，一般的に相同組換えによる分泌タンパクの発現量はどのくらい期待できるのでしょうか？相同組換え初心者ですので，経験者の方よろしくお願いします．
- ベストアンサー
- 生物学
- 発現蛋白質の精製
酵母を用いて組換え型蛋白質の発現・精製を行っています． 酵母を培養することにより，培養上清に蛋白質が発現してきます．この培養上清を，60％硫安+等電点で沈殿させた後，緩衝液で再溶解させ，陰イオン交換カラムで精製します． ところが，硫安+等電点沈殿させた蛋白質が上手く再溶解してくれません．溶解しない分画にもかなりの量の目的蛋白質がありましたので，どうにか溶解させようとトリトンを加えて溶解させました．しかし，今度はその加えたトリトンが最後まで残ってしまいました． 沈殿してしまった蛋白質を再溶解させる他の方法，またはトリトンを抜く方法をお知りの方がいれば，アドバイス等お願いします．
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパクの発現に関して
あるタンパクの発現を試みているのですがまったく発現しません。意見をいただけると幸いです。よろしくお願いします。以下条件です。 使用ベクター：Qiagen pQE30 発現させるタンパクの由来、鎖長：植物由来、約800bp ホスト：E.coli M15[pREP4]およびBL21(DE3)plyS 培養条件：37℃で培養後、OD600=0.6のとき1mM IPTGを添加、その後25℃で一晩培養。 そのほか、SDS-PAGEにて可溶性・不溶性画分どちらも調べましたが、目的タンパクはありませんでした。ベクター＆インサートDNAはBamHIおよびPstIで切断し、ライゲーションしました。シークエンスも確認しましたが問題ありません。 必要なことがあれば追加します。どんな些細なことでもかまいません。どしどし意見をお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 大腸菌でタンパク質の発現
大腸菌でタンパク質の発現させたのですが、すべて不溶性画分に発現していて、リコンビナント酵素を得ることが出来ません。これまでIPTG濃度、培養時間、コンピテントセル、ベクター等検討しましたが、だめでした。どうしたら発現しますか？pET3aで発現しなかったため、今ベクターはpColdベクターです。
- ベストアンサー
- 生物学
- 不溶性蛋白の可溶化（組み換え蛋白の発現）
いつもお世話になっております。 組み換え蛋白をGST融合蛋白として発現させる系をおこなっております。 目的の蛋白が不溶姓にでてくるのですが、これを可溶化させるために次の方法を考えております。 1、界面活性剤を用いて再可溶化 2,cold発現ベクターでの発現 これ以外にこうやったら可溶化したよ、という方いらっしゃいましたらお教えいただけたら幸いです。 最初の可溶化はPBSにリゾチームを添加したもので凍結融解を10回くりかえして行っています。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
丁寧な回答ありがとうございます。 こういう実験は、初めてです。 アドバイスにあるように再度、条件、cDNAなど一つ一つ確認してみます。 ありがとうございました。