• ベストアンサー

実験方法で・・・(ウェスタンブロット)

courregesの回答

  • ベストアンサー
  • courreges
  • ベストアンサー率60% (6/10)
回答No.1

以下のサイトにプロトコールが出ています. 検出系は異なっても原理は同じですからそのまま利用できると思います(あ,もちろんアルフォスだとだめですが) ちなみにメンブレンは4社ほど比較しましたが,いずれも使用できます. ただ,抗原によって最適なメンブレンは異なりますが. ちなみに少なくともこの検出系では5回のリプロービングまでは問題なく検出できました.

参考URL:
http://www.jp.apbiotech.com/kouryaku/Chap_7/ECLPlus.asp
fuckie79
質問者

お礼

まさにECLを使っていたのですが、ウチの学校でリプロービングをしている人がいなくて不安でしかたなかったんです。おかげで安心して抗体はずせます。本当に感謝してます。ありがとうございました。頑張っていい卒論かきます

関連するQ&A

  • ウエスタンブロットの抗体について

    ウエスタンブロットの抗体について ウエスタンブロット初心者なのですが、抗体について質問です。 EGFRの発現とリン酸化について調べたいのですが、その場合一次抗体は何を買うべきでしょうか? 調べると、anti-EGFR antibody、antiphosphotyrosine antibodies PY 20 and PT 66 を使った論文が出てきましたが、よく分からないです。 抗体のカタログを見るとリン酸化EGFRと書いてある抗体もあります。 お詳しい方、実験の手順も含めて教えていただけると助かります。

  • ウエスタンブロット法について。

    こんばんは。 ウエスタンブロットについて行き詰っています。 実験で1次抗体にβ-アクチンを使用しているのですが、 どのような意味があるのでしょうか? β-アクチンを使用することから、予想される目標物質とは何があるでしょうか? よろしくお願いします。

  • ウエスタンブロットは上手くいかないが免疫染色可能な場合

    実験経験の浅い者です。初めて質問します。 細胞質、細胞膜上で発現しているあるタンパクに対する抗体を作成中です。既報にならって、合成ペプチドから抗体(血清)を作成しました。 目的の抗体ができているかを確かめるために、ELISA、ウエスタンブロット、免疫染色をしたのですが、ELSA、免疫染色は問題なく、ウエスタンブロットだけうまくバンドがでませんでした(非特異的なバンドのみ)。 発現しているはずの細胞を抗原としてβ-メルカプトエタノール、SDS入りのサンプルバッファーで溶解処理して、通常のSDS-PAGE、1次抗体は血清、2次抗体はWB用の抗体を使用しました。 免疫染色では、血清を2000倍希釈しても十分染色できました。 高次構造が変わると抗原性がなくなってしまうということなのでしょうか。 だとすると、ウエスタンブロットでは、還元剤なしにするとよいのでしょうか?何かよい方法はありますでしょうか。 よろしくお願い致します。

  • ウエスタンブロットと免疫染色について

    同じ抗体と細胞を用いて、ウエスタンブロットと免疫染色をした場合に、ウエスタンブロットで反応があっても、免疫染色では反応が見られないなどということが起こったりするのでしょうか??ご存知の方がいらっしゃったらぜひ教えてください。

  • ウエスタンブロットのトラブルシューティングについて

    今、細胞内のICAM1の発現を確認するための実験をウエスタンブロット法で取り組んでいるのですが、中々うまくいきません。 抗体の種類や抗体の希釈率、希釈液の種類、転写時間、洗いの時間など色々やりましたが、いずれも非特異的なバンドがズラっと出てきてしまいます。バックグランドはきれいなので、サンプルの量が多いのではと思っているのですが、どのくらいサンプルの量を減らせばいいのか分かりません。こういう場合、ゲル染色(銀染色?あるいはCBB染色?)でサンプル内のICAM1の含有量を測定すると聞いたのですが、本当にゲル染色をする必要があるのでしょうか。

  • ウエスタンブロットについて

    始めまして。 現在、ウエスタンブロットにより蛋白の検出を行っているのですが、うまくいきません。どなたかアドバイスをいただけませんか。。 human由来の抗体で、私のサンプルは違う動物種なのですが、抗原認識部位の相同性は97%でした。 内部標準の検出はうまくいくのですが、目的の蛋白の検出は何度条件を変えてやってみてもうまくいきません。 目的の分子量の部分には、非特異が多いのもあり、なかなかバンドが確認できません。しかし、一度だけ、非特異はあったものの発現量の比較も出来るほどのバンドが出たこともあります。 しかし、同じ条件で行ってもきれいなバンドはその一度だけしか見られていません。 非特異が多いので、二次抗体の希釈を変え、何度もやってみてはいるのですが、目的の蛋白は検出できていません。 現在、違う抗体を購入しようか検討中なのですが・・・。 まだ、同じ抗体でやってみる価値があるのかどうか、どなたかご助言いただけたらなと思います。よろしく願いいたします。

  • ウェスタンブロットの検出で

    題字の如くなのですが、HAタグをつけた融合タンパク質をサンプルに泳動後、ウェスタンブロットでanti-HA mouse IgGで検出するという実験を行いました。二次抗体はanti-mouse IgG HRP conjugatedです。 しかし、抗体処理後にアマシャム社のECLキットを用いて発色操作をしたところ、今まで何もなかったメンブレン上に茶色いバンドが出現しました。これは目的のタンパク質が多量に発現しているのだろうと思い、LAS-1000イメージアナライザーでバンドを検出しましたら、メンブレン上に見えていたバンドの位置に全くバンドが検出されませんでした。 怪しいところと言うと、抗体処理、あるいはブロッキングの段階が考えられますが、メンブレン上にバンドが見えるのに、それを読み取れなかったと言う経験をお持ちの方、いらっしゃいましたら考えられそうな原因を何でもいいので教えて下さい。お願いします。

  • ウェスタンブロットについて

    先日、ウェスタンブロットをしていて発色試薬を入れて3分後にメンブランを見てみるとメンブラン上に茶色いバンドが現れていました。 このバンドの原因が何か分からないので 分かる方いらしゃいましたらよろしくお願いします。 サンプルは、GSTタグで50倍希釈しました。

  • ウェスタンブロットについて質問です

    私が所属している大学の研究室ではSDS-PAGE→メンブレンへの転写→一次抗体反応→二次抗体反応→DAB染色の手順でウェスタンブロットを行なっています。 そこで質問ですが、タンパク質をメンブレンへ転写後にそのメンブレンをストックすることはできるのでしょうか?また、ストックできるのであればどのような方法でストックすればよいのでしょうか? どなたか回答よろしくお願いします。

  • ウエスタンブロット 発色の原理は・・・

    こんにちは。よろしくお願いします。 職場で、ウエスタンブロットを行っています。 タンパク質を転写したメンブレンに、サンプルを反応させて、1次抗体、2次抗体後、過酸化水素ごく少量にDABを入れて、しばらく置くと発色し、水中に入れ反応を止めます。 ここで、そぼくな疑問なのですが、過酸化水素とDABを入れるとどうして発色するのでしょうか? DABがペルオキシダーゼ基質ということは知っています。 色々ネットで調べましたが分かりませんでした。 よろしくお願いします。