クロマトグラフィーでの分子量測定

質問

ある実験の分析項目に、
２つのクロマト使ったと書いてありました。、

HPSEC (μ-Bondagel column)
GPC (Sepharose CL-6B)

どちらとも大きな分子を先に通すということで
原理としては同じなのかなと思ったのです。
分離させていたのは、タンパク質なんですが・・・。

セファロースはアガロースが集まった(？)ものだと
記憶しているのですが、HPSECのゲルが何か判りませんでした。

この両者、単に分子量で篩い分けているのではないのですか？
分子量を測定するのが目的だったようなので
同じことを、二通りの方法で行っただけなのでしょうか？

回答No.3

Julius · ベストアンサー

すみません。
私は完全にゲルカラムの仕組みを間違えて(教わり)覚えて(教えて)いました。
私自身は分子量200~1000程度の有機物・錯体を分けるのに、2,30回ほど
ゲルカラムとHPLCを使ったのですが、分ける物質の分子量に大きな違いが無かったので、
溶出する順番はしばしば逆転していました。

お礼

参考になりました、ありがとうございます。

回答No.5

p_nonoko

こんにちは。
GPCの原理は流体力学の世界に行き着きます。
卑近な例では、キャラメルコーンの袋を振っていると、小さな粒であるピーナッツがどんどん底の方に沈んで、大きな粒であるキャラメルコーンが上の方へ競り上がって来ますね。
あの原理です。
粒子径の大きい方がぶつかりあって、流体として先に出て来ます。
なので、ふるい分けているのではありません。
GPCとHPSECの最大の違いは、測定溶液の濃度です。
分子量の測定だけでしたら、GPCで十分なのですが、欲しい物質を分取する場合、より早くより多くの溶質が出て来てほしいわけです。
GPCは希薄溶液しか適用できませんが、HPSECは高濃度溶液が使用できますし、リテンションタイムも短縮できるので便利です。
おそらくその実験は、分取精製したものを、その後、何かの別の測定か合成に使用したのではないでしょうか？

回答No.4

easylife

no.2さんのおっしゃるように、比較して一致を見たという気がしますが、測定法が異なるので、完全に一致するということはまあ期待できないと思われます。
タンパク質が合成したものでしたら、2種の方法で分子量分布を比較したかったのかもしれません。
タンパク質ならば分布は狭いはずなので。

HPSECについてはよく知らないですが、GPCでは、分子が吸着しながらゲルの中を通過するとき、小さい分子（分子量の小さな分子）のほうがより長い経路を通ることになるので、出てくる時間が長くなります。
つまり、小さな分子ほど遅く出てきます。

固定相と移動相を組み合わせて複数の成分を分離する方法をクロマトグラフィーといいますが、これは、単なる「ふるい」とは全く異なります。
（クロマトグラフィーでも、ガスクロは、小さな分子のほうが早く出ます。）

回答No.2

mizu_atsu

質問の答ではありませんが念のため。
ゲル濾過は大きな分子ほど先に出てきますのでminiRHさんの記述は正しいものです。

記述のゲルは使ったことがありませんが、カラムにはそれぞれ測定できる最適範囲があり、その範囲はマチマチです。
また、その範囲が同じようなものであったとしてもゲルの構造が違ったりするため同じタンパクを流しても多少違った位置に出てくる可能性はあると思います。
このため同じタンパクを2種のカラムに流して両方でほぼ同じ値がでる、だからこのタンパクの分子量は○○だと言いたいのだとおもいます。

回答No.1

Julius

ゲルカラムでは、分子量の大きいものが
ゲルに絡むことにより、後から出てきます。

実際の実験の目的は分かりませんが、
それぞれの測定で生じる誤差を考慮して、
複数の方法で分子量を測定しただけではないのですか？