胚発生におけるwesternのコントロールについて

質問

現在、ショウジョウバエの胚発生に伴うあるタンパク量の変化をwesternblotを用いて行おうと考えています。

そして、タンパク量が同等であることを示すためのコントロールとしてヒストンH4抗体を用いるように言われ、その際は深く考えずにいましたが、よくよく考えてみると胚発生に伴って細胞数が増加し、総DNA量も増加することでヒストンが増加するために、コントロールにならない気がしました。

これはどのように解釈すればよろしいのでしょうか？
よろしくお願いします。

回答No.1

otx

まず、間違ってはいけないことがあります。

サンプル間のタンパク質量を同等にするということは、
サンプルのタンパク質の量を定量して同じタンパク質溶液として調整するということ。
です。

ヒストンのバンドを同等になるようにするということは、
あくまで、そのサンプル間に含まれるヒストンタンパク質の量を同じにしたということ、
他のタンパク質量は同じとは限らない、つまりサンプル間のタンパク質の総量が同じとは限らないです。

ただ、ヒストンは細胞ひとつひとつにだいたい同じ量含まれると思われるので、
ヒストンの量を見れば、だいたいタンパク質量も同じだろう、とみんな考えていますが。

＞タンパク量が同等であることを示すためのコントロールとしてヒストンH4抗体を用いるように言われ、

しかし、この文章は正確に言うと、間違いになります。
（作業としてやりたいこと、言わんとすることはわかりますが）

で、本題ですが、

＞よくよく考えてみると胚発生に伴って細胞数が増加し、総DNA量も増加することでヒストンが増加するために、コントロールにならない気がしました。

おっしゃる通りです。

目的のタンパク質を発現している細胞が「胚の一部の細胞」であるのならば、

発現している細胞では、発現量が変化なし（もしくは上がっていても）であっても、
徐々に増加してくる発現していない細胞に、「薄められて」
あたかも発現量が減るように見えるでしょう。

これは、サンプル間のタンパク質量を同じにした場合でも同様です。

そのようなことが考えられる場合、
私だったら、サンプル間の「胚の数」を合わせてサンプル調整をします。
そうすれば、各ステージの胚内においてどのくらい、そのタンパク質があるかわかります。
この場合、サンプルに含まれるタンパク質量、ヒストン量は違うかもしれません。

ただ、目的のタンパク質が胚のほぼすべての細胞に発現しているのであれば、
タンパク質量、もしくはヒストン量でもモノは言えると思います。

問題は、何を示したいかということです。