プライマー設計

質問

プライマー設計

PCRのプライマーの設計のポイントに
「部分的にGCあるいはATに片寄らず、特に非特異的な反応を避けるため、プライマーの3’側はGCリッチにならないようにする」
という文があるのですが、それは、
同じ塩基が続く箇所やタンデムリピートなどの繰り返し配列は特異性を損なうため避ける必要があるということと、GC リッチだとプライマー同士やプライマーの分子内で結合してしまいPCR反応が進まなくなることがあり、また遺伝子の構造上GCリッチな領域も存在するので、そちらに結合してしまうこともあるから。という解釈であっていますでしょうか？

また、他の記述に
「プライマー3’末端をGCとすることで、その部分の二本鎖がアニーリングの温度を上げても維持されやすくなり、より特異的なPCR反応が期待できます」
というものもありました。
3'末端は結局GCリッチのほうがよいのでしょうか？GCリッチじゃないほうがよいのでしょうか？

基本的なこととは思いますが、ご回答よろしくお願い致します。

回答No.1

otx · ベストアンサー

程度に依る、ということです。

まず細かいことですが、言葉の程度ですが、
CGリッチとGCにすることは違います。

質問者さんの書かれた文章をもう一度読んでみて下さい。

＞部分的にGCあるいはATに片寄らず、特に非特異的な反応を避けるため、プライマーの3’側は「GCリッチ」にならないようにする

＞プライマー3’末端を「GCとすること」で、その部分の二本鎖がアニーリングの温度を上げても維持されやすくなり、より特異的なPCR反応が期待できます

「CGリッチ」とは、「CGだらけ」ということです。そうすることについての弊害は色々考えられると思いますが、
質問者さんがおっしゃることも言えると思います。

「CGにすること」とは３’末端を「２、３個（だらけではない）CGにすること」です。
これは、DNAポリメラーゼの性質に依るところなのですが、
例えば、２０塩基のプライマーで、５’末端の２、３個の塩基が外れていても
DNAポリメラーゼがプライマーからDNAをのばすことが出来ますが、

２０塩基のプライマーのうち１９個が結合していても、３’末端の１個の塩基が結合していないと
DNAポリメラーゼはDNAをのばすことが出来ません。

なので、ある意味、おまじない程度かもしれませんが、最も単純な計算では
ATの各々は２℃、CGの各々は４℃というTm値を持っているので、
どっちかというと「３’末端はCGがある方がいい」ということです。

「CGリッチ（CGだらけ）」と「CGが会った方がいい（だらけではない）」
あとは感覚でどのくらいかということです。

ただ、結局はPCRやってみないとわからないというのが真実で、
理屈をこねて作ってみてもその通りにならないことなんて、沢山あります。

お礼

ご回答ありがとうございます。
とても詳しく書いていただきとても分かりやすかったです！
本当にありがとうございます！！