- ベストアンサー
SDS-PAGE 移動度について
こんにちは！！ 大変初歩的な質問で申し訳ないのですが、ご回答お願いいたします。 大学でタンパク質の精製実験をし、チトクロムCの純度が上がっていくのを確認するためにSDS-PAGEをおこないました。 SDS-PAGEでは、マーカーのRf値と分子量の対数値をプロットしたグラフを作成し、そこから分子量未知の試料の分子量を求めるということは理解しています。 Rf値は、ブロモフェノールブルーの移動度を1とした各試料の相対移動度であるということですが、ブロモフェノールブルーの移動度はどこからわかるのでしょうか。 SDS-PAGEの結果のカラーコピーがあるのですが、これをものさしで測ってやればいいのでしょうか？(>_<) ご回答お願いします。 あと、試料は、タンパク質精製のいろいろな段階からとったもので3種類あります。これらの試料から、チトクロムCの純度を求めるのですが、これはSDS-PAGEで染色されたすべての部分の総分子量(1)とチトクロムCの分子量(2)をもちいて、 (2)/(1)で求めればいいのでしょうか？ いろいろな文献を読んでもわかりませんでした。 大変初歩的で申し訳ないですが、ご返答よろしくお願いします。
- goma38
- お礼率100% (6/6)
- 生物学
- 回答数5
- ありがとう数9
- みんなの回答 （5）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
実習みたいな中身だけど、それなら担当教官に訊けば良いと思うが・・・？ >ブロモフェノールブルーの移動度を1とした各試料の相対移動度であるということですが、ブロモフェ ノールブルーの移動度はどこからわかるのでしょうか。 意味がよくわかりませんが、ブロモフェノールブルーがどれだか解らないのですか？ >SDS-PAGEの結果のカラーコピーがあるのですが、これをものさしで測ってやればいいのでしょうか？ はい、そうです。普通はゲル上端からの距離を測ります。 ところで、バンドには太さがありますね。バンドの上端、真ん中、下端間での距離のうちどこが良いと思 いますか？ 全てに当てはまるわけでは無いのですが、下端をおすすめします。なぜかというと、タンパ ク質量をどんどん増やしてみます。するとバンドはどんどん太くなり、それにつれて、真ん中と上端の位 置はどんどん上がっていきますが、下端の位置はほぼ同じです（かなり大量になるともちろん下がって きます）。比較的タンパク質量に依らずたいてい同じ位置になるので（ときどきあれ？というのはあるの ですが）、下端が一番おすすめです。 >タンパク質精製のいろいろな段階からとったもので3種類あります。これらの試料から、チトクロムCの 純度を求めるのですが、これはSDS-PAGEで染色されたすべての部分の総分子量(1)とチトクロムC の分子量(2)をもちいて, (2)/(1)で求めればいいのでしょうか？ 全然違います。どのくらい純度があるかというのですから、チトクロムCのタンパク質量（重さ、つまり単 位はｍｇとか）/全タンパク質量（チトクロムCの量+それ以外のタンパク質量）、これが純度です。 しかし、ゲルの中のタンパク質の量を重さで求めるのは無理があるので、タンパク質量と染色の濃さ は比例し、かつ全てのタンパク質で比例常数は同じと仮定します。つまり、どのタンパク質のバンドで あっても、バンドの染色の濃さをそのタンパク質の量としてしまうと言う意味です。 従ってスキャンイングのパ ターンが必要になります。そこから、足し算、割り算をしてください。
その他の回答 (4)
- teru-arai
- ベストアンサー率74% (40/54)
>はい、ブロモフェノールブルーがどれだかわからないです ブロモフェノールブルーは、泳動の先端付近にあります。青い（青紫か）色素ですけど、どれだか解らないの じゃなくて、無いのですか。 無いのは二つの理由が考えられます。 一つはNo2さんが書かれてますが、泳動時間が長すぎて、ゲルの外へ出てしまった場合。 二つめはBPBは割と簡単に拡散するので、ゲルの染色脱色中に見えなくなってしまうこともあります。こ の場合は、泳動の先端が解るのでそこを使えばいいと思いますが、慣れてないと難しいか・・。 解らないときの処置。普通、ゲルの両端のレーンの泳動は少し遅れますが、内側の他のレーンは皆ほぼ同 じように動いており、内側のレーンのBPBの泳動位置は皆ほぼ同じに成ることが多いです。つまり、分母は 皆同じという意味です。
お礼
teru-arai様 再度アドバイスいただき、本当にありがとうございました。 ようやく、理解が深まってきました。 ご指摘の通り、結果を見てみると、泳動先端の位置が大体わかりました。すごくうれしかったです。 今回は私の勉強不足のために、これほどたくさんのかたにお助けいただきました。 よく復習して、しっかりと身につけたいと思います。 ありがとうございました！
- naonao0088
- ベストアンサー率0% (0/1)
RF値は、定規などで測って求めればいいんですよ。 もしかして、泳動先端がどこか分からないということですか？ サンプルを何種類か流しているようですが、一番下に全て同じように濃いバンドが見えると思います。ゲルの上端から、この泳動先端までの長さで、ゲル上端から各バンドの長さを割ればいいんですよ。 参考になったでしょうか。 頑張ってください。
お礼
naonao0088様 ご回答ありがとうございました！ 結果をみると、何らかの原因でBPBの泳動先端が見えなくなっていました。それで泳動先端がどれなのかわかりませんでした。 しかし、やっとSDS-PAGEについて理解が深まってきました。 問題に付き合ってくださって、本当にありがとうございました。
移動度は物差しかなんかで計ればいいのでは？ バンドがいっぱい＝いろんなモンが入っている バンドが１つ＝一つのものしか入ってない＝純度高い て感じじゃないでしょうか？
お礼
asa1201様 ご回答ありがとうございました！ 移動度はものさしで測ればいいと伺って、安心しました。 純度について、確かにバンドの数を見比べることで純度の大小が推定でき、バンドの位置によって分子量もある程度推定できることはわかったのですが、今回の実験では実際に純度を計算しなければならないので困っていました。 とても基本的なことを質問させていただき、大変恐縮でしたが、お答えいただきありがとうございました。
- xen1234
- ベストアンサー率25% (15/60)
そもそも、ブロモフェノールブルーとは何かわかりますか？実験方法とかをよく見てください。 サンプルが青色であったと思いますが、その青色の色素がブロモフェノールブルーです。 この色素はサンプルをアプライするときにわかりやすいとか、電気泳動がどのくらい進行したかということを目的に入れてあります。 ゆえに、電気泳動したゲルの一番下にある青いラインがブロモフェノールブルーです。 時々、時間を長く泳動した場合はその色素がゲルから流れてしまって無くなることもありますが。 もう少し、実験の内容とやっている意味を把握することが大事です。 このままでは全く実験をやっている意味がありません。 頑張ってください。
お礼
xent234様 ご教示ありがとうございました！ 結果では、ブロモフェノールブルーの青いラインは見えない状態になっていましたが、xent234様のご返事を読んで、やっと疑問が解けました。 今回の実験に関しては、私も勉強不足を強く感じております。申し訳ありませんでした。 それにも関らず、教えてくださってありがとうございました。
関連するQ&A
- SDS-PAGEについて
大学の実験でやったSDS-PAGEのレポートを書くんですが、タンパク質の分子量と泳動度を使いグラフを作る課題があるんですが、ｋDというのが分子量だとは思うのですが泳動度をどのように求めたら良いのかがわかりません。参考書に比移動度というのがあり、分子量の対数に逆比例する。と書かれているものがあったのですが、これと泳動度は同じものなのでしょうか？この実験には分子量マーカーと成分のわからないタンパクを使ったのですが、マーカーを使いグラフを書くんでしょうか？生物系はまったく判らないのでよろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 化学
- SDS-PAGEについて
タンパク電気泳動の際、SDSを加えることにより、もともとの電荷（プラスやらマイナスやらタンパク独自が保有していた電荷）をマイナスに帯電させますよね。そして電流を流し、アクリルアミドゲル中で分子ふるいにかけ分子量ごとに分離させるんですよね。 そこで質問ですが、タンパクの分子量に関わらず結合するSDS量というのは一定なのでしょうか。 現在就職活動中で先日技術面接時に、「タンパクの分子量によって結合するSDSの量も変わるの？」って聞かれて「はい」って答えたら、「違う量のSDS結合したらそれだけで流れ方変わってくるでしょうが。同じ量のSDSが結合して、そして分子ふるいにかけるんだよ」って叱られました（笑） 自分で調べたうちではタンパク１ｇに対しSDS１.４ｇが結合するという記載もあったので、タンパク分子量によりSDS結合量も違うと思うのですが。 SDS結合量依存的に流れ方は変わるのでしょうか。どうなのでしょうか、ぜひとも意見をお聞かせください。
- 締切済み
- 生物学
- SDS-PAGEについて
SDS-PAGEの結果分子量が本来得られる結果よりも大きく出てしまう場合については知っているのですが、逆に小さく出てしまうことはあるのですか？また原因は何ですか？
- 締切済み
- 生物学
- SDS-PAGEのバンドの位置のズレ
SDS-PAGEのバンドの位置のズレ こんにちは。 早速質問ですが、この前SDS-PAGEを行いました。 計算上の分子量50kDaのタンパク質を大腸菌で発現させた後、 SDS-PAGEにかけて発現を確認しました。 すると、54kDa付近にそれらしきバンドが見られました。 IPTGで誘導をかけていないものも、54kDa付近に少し太めのバンドがありましたが、誘導をかけたものはそれよりもさらに太いバンドです。 4kDaっていうのは誤差の範囲ですか？分子量マーカーの説明書には、「このマーカーから正確な分子量を求めるのは向いていません」と書いてありました。調べてみますと、これくらいの誤差はよくあることみたいなのですが・・・
- ベストアンサー
- 生物学
- SDS-PAGEゲルのトラブル
あるタンパク質を生体物質から私の研究室（かなり小規模な研究室なので聞ける人があまりいないのです。）では精製していて、随分以前からそのタンパク質が精製できているかどうかをSDS-PAGEゲル上で確認していました。 ところが、ここ1ヶ月ほど前からそのSDSーPAGEゲルの電気泳動結果がおかしいのです。。 例えば、 *本来あるはずの低分子タンパク質のバンドが薄くしか（もしくは全く）見えない。高分子領域にスメアがたくさん見える。 *本来サンプルがアプライされているはずのないレーンにスメアっぽいバンドがたくさん見える。（特に高分子領域に） *バンドはかなりスメアっぽく見える。（シャープなバンドではない。） あと気づいたことですが、泳動直後のゲルはかなり暖かくなっていました。 このような原因として何が考えられるでしょうか？本当に困っています。 ちなみに、私たちの研究室では、 *SDS-PAGEゲルは自作 ポリアクリルアミド、SDS等を水溶液にしたものが冷蔵庫にストックされていて（2.3ヶ月前に作られました）、その水溶液と常時調製している10％APS溶液そしてTEMDを混ぜ合わせて常に作っています。 *ローディングバッファー 半年ちょっと前に作られて冷蔵庫にストックされたものを使っています。 *泳動用バッファー 10倍のTrisベースのバッファーが常温でストックされているので、それを随時希釈して使っています。 *泳動条件 150V（電気泳動ユニットに異常は見られません。）
- 締切済み
- 生物学
- SDS－PAGEの分子量
SDS－PAGEであるたんぱく質の断片を泳動したのですが、分子量は小さいはずなのに、それより分子量が大きいものよりも上のほうにバンドが検出されました。 私なりに考えた結果酸性アミノ酸（Asp,Glu)が多く含まれているので流れにくかったと考えたのですが、そのほかに考えられる理由はあるのでしょうか？ pIが大きく違うのですが、これは関係あるのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- Native-PAGE SDS-PAGE 分子マーカー 電気泳動
Native-PAGEに用いる分子マーカーを探しています。 Native-PAGEを行ったときに、SDS-PAGEに用いる分子マーカーを使用したところ泳動速度が違ったせいかsampleの進み方が遅かったようです。 私の目的分子量の大きさは25-50kDaあたりなのです。 Native-PAGEでこの大きさのタンパクを見る場合、適した分子マーカーがありましたら、教えていただけないでしょうか？ よろしくお願いします
- ベストアンサー
- 生物学
- SDS-PAGEのマーカー
SDSーPAGEの分子量マーカーが曲がって出てきてしまうのですが、原因は何が考えられますか？？ この分子量マーカーは、Amershamというところの「LMW Calibration Kit For SDS Electrophoresis」というものを使用しています。 ゲルは１２．５％のもので、電圧は２０Aで電気泳動を行ってます。
- ベストアンサー
- 生物学
- SDS-PAGE用マーカー
SDS-PAGE用マーカー 培養上清を限外濾過で濃縮し、100KDa以上1000KDa以下のタンパクをターゲットに考えSDS-PAGEを行っているところですが、200KDaくらいまでのタンパク量のサイズマーカーしか持っていません。ネットで調べているのですが見つけられないので、教えて頂きたいと存じます。ちなみに、複合体を作ったタンパクである可能性があるため、BN-PAGEを行うことも考えていますが、その場合はサイズマーカーはまた別物なのでしょうか？どうぞよろしくお願い申し上げます。
- ベストアンサー
- 生物学
- 低分子蛋白量のSDS-PAGEについて
分子量15kDaの蛋白質を15%SDS-PAGEでウェスタンブロティングしています。それまでとてもきれいに出ていてloadingする蛋白量もかえていないのにここ数週間、突然バンドがでなくなったり、でても細く極端にまがったりするようになってとても困っています。Sample buffer(loading buffer)を手作りしており、その影響かもしれないとおもって何度もつくり直すのですが同じ結果です。 何がいけないのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
teru-arai様 早速のお返事ありがとうございました。 とても詳しくご教示くださり、ありがとうございます。 >ブロモフェノールブルーの移動度を1とした各試料の相対移動度であるということですが、ブロモフェ ノールブルーの移動度はどこからわかるのでしょうか。 意味がよくわかりませんが、ブロモフェノールブルーがどれだか解らないのですか？ はい、ブロモフェノールブルーがどれだかわからないです・・・マーカーと試料123の結果しかないのですが、どこをみればわかるのでしょうか。すいません。。。 他は理解できました。 確かに、担当教員の方にきくべきでしたが、勉強不足だったので、実習中に聞くことが出来ませんでした。担当されている先生はご多忙なため、締め切りまでに会うことができません。 こちらの勉強不足を大変反省しております。 ありがとうございました。 重ねて恐縮ですが、上の質問について、できればご返答くださるとうれしいです。