cDNA 定量

質問

一定量のRNAをインプットして、cDNAを作製した後、リアルタイムPCRに進む前にcDNAの濃度は測定したほうがいいのでしょうか？そうした場合、RT-PCR反応でのランダムプライマーやdNTPは、分光光度計による測定でどの程度影響するのでしょうか？

回答No.3

rio2 · ベストアンサー

PCR産物や逆転写産物を分光光度計で測定することは余計な混乱を招きますし、そもそもdNTPや一本鎖は吸光係数が高くなり同一の溶液中で測定すること自体できません。例えば、RNA溶液にRNaseを入れてみると経時的に吸光度が向上しますよ。吸光度で測定不可能なことは、試しに機知濃度のDNAもしくはRNAサンプルにdNTPやプライマーを入れて測定してみるとわかると思います。

この場合、
(1)ゲル電気泳動で機知濃度の一本鎖DNA(primerが適当？)を用いて検出したバンドの相対的に蛍光度から濃度を決定する。
(2)PicoGreen（Molecular Probe; Invitrogen）を用いる。プレートリーダーでもセルタイプでもいいので蛍光光度計が必要。
(3)Agilent BioAnalyzer2000 (Agilent Technology)を用いる。専用機が必要。
(4)念入りな精製過程を経て吸光度測定する。
が、今思いつく測定手段です。

お礼

ご返答ありがとうございました。”dNTPや一本鎖は吸光係数が高くなり同一の溶液中で測定すること自体できません。”これが、一番知りたかった答えです。つまり、逆転写産物を分光光度計で測定すると、おかしな計測値が得られ、意味がないと言うことですね。

回答No.2

f_f_06

私自身がやっているわけではないので、参考までに、ですが。

リアルタイムPCRを行う上で、テンプレート量がある程度は揃っていなければ話にならないと思いますので、
まったくの無駄ではないと思います。
280nmの吸光度による濃度測定ではなく、SYBRGreenのような何か色素を使った濃度測定をしてみてはいかがでしょうか？
RNAの影響は、DNAに特異的に結合するような色素を用いることでクリアできると思います。
ただし、プライマー（ダイマー）の影響は避けられないのも事実だと思います。
どうしてもというのなら、精製を行えば除去できますが、cDNAのロスもまぬがれません。

お礼

ご意見ありがとうございました。しかしながら、リアルタイムPCRを行う上で、SYBRGreenの性質上2本鎖DNAのみに結合すること、およびRNA抽出の際のDNase treatmentを行なっているので、RNA,genomic DNAの影響はさほど心配していません。プライマー（ダイマー）の影響に関しても、実際にリアルタイムPCRを行う前に、濃度の最適化を行なうのでそれも無視できるレベルまで持っていくことができていると思います。テンプレート無しのnegative contorolにはmelting curve analysisで一定のピークが見られないので。
　一番の気になる点と言うのは、サンプルが限られている場合、濃度を知っていれば、最小限のサンプル（例えば、10ナノグラム）をリアルタイムPCRで用いられ、より多くの特定遺伝子の発現量を同サンプルで確認できることです。

回答No.1

MIYD

テンプレートのRNAやランダムプライマーなどを測定してしまうので、
測定しても有益なデータは得られないと思います。

お礼

ご回答ありがとうございました。ネガティブコントロール（テンプレート無し）でもしかっりと測定されるので、そうではないかと思いました。