アミノ酸の配列の同定について

質問

先日こちら
http://oshiete1.goo.ne.jp/qa3008222.html?ans_count_asc=20
で質問させていただいた者です。
質問の日本語がわかりにくいのともう少しつっこんで質問したので
もう一度質問させてください。

今、質量分析によるタンパク質の同定について調べているのですが、
前回回答いただいたこともあり、その方法には、ペプチドマスフィン
ガープリンティング法、シークエンスタグ法、de novoシークエンス
タグ法の３つがあることがわかりました。しかし、どの方法も、質量
分析を行いデータベースを検索して一致するものを探すぐらいのこと
しか紹介されておらずその詳細についてはあまりわかりませんでした。

私が特に疑問に思うのは、ペプチドの質量からどのようにアミノ酸の
配列がわかるのかということです。例えば、分析の結果からK、L、M、
Rといったアミノ酸が推定できたとしても、その並べ方は４！通りある
ので配列は決められないと思うのですがどうなのでしょうか。

回答No.4

MIYD · ベストアンサー

#2です。
>つまり、多量にあるペプチドの質量のデータから先にタン
>パク質を同定して、その後
>タンパク質のデータベースからアミノ酸の配列を同定する
>ということでよろしいのでしょうか。

あっています。
ただ、現在の主流は、#1,3の方が書かれているMS/MSです。
トリプシンで切断して、それぞれの断片の配列を調べるというやり方で、あるタンパク質の大体80~90%の配列をカバーできれば、(そして他のタンパク質が該当しなければ)
そのタンパク質として進めています。
(共同研究先に委託していたので詳しい計算法が分かりませんが)

例えば、自分が注目しているアミノ酸(多型や修飾があるもの)が読めていない場合、
キモトリプシンなどの他の酵素で消化してみる場合もあります。

お礼

お礼が遅くなりまして申し訳ございません。
#1,3の方と合わせて質量分析に対する理解が深まりました。
たびたびのご回答ありがとうございました。

回答No.3

miya_0726

ANo.1です

先ほどの回答でも書いたのですが、タンパク質全体をランダムで切断すると、パズルを解くのが非常に大変なのです。
そのため、２段階に分けています。

(1)トリプシンで分解すると、そのタンパク質の特定の箇所で切断され、その長さに応じて各断片を分取することができます。
(2)分取したそれぞれのペプチド断片を改めてランダムに切断し、質量分析とパズルによってそのアミノ酸配列を決定します。ここでは各断片を独立して配列決定します。
(3)最後に、元のタンパク質をトリプシンで部分分解し質量分析した情報を元に、決定されたペプチド断片をつなぎ合わせて完成です。

理論的にはこれでアミノ酸配列は決まるのですが、実際には時間もコストもかかってしまうため、アミノ酸全長の配列を決めることはまれです。ANo.2さんの回答されている通り、配列決定はタンパク質の一部にとどめ、相同性検索などにより素性を明らかにし、遺伝子のクローニング等に持ち込むことがほとんどだと思います。

お礼

すみません、２段階になっていることがわかっていませんでした。
ご丁寧な説明ありがとうございます。とても理解が深まりました。
回答ありがとうございました。

回答No.2

MIYD

質問の日本語が分かりにくいのではなく、
質問者さんが各解析方法が何をしていて、何を知ることが出来るのかを調べていないことが理解できない原因ではないでしょうか。

フィンガープリンティング法、シークエンスタグ法は、
解析したペプチドのデータを、
既知のタンパク質から得られているペプチドの質量のデータベースと照合する解析法です。
その結果からは、配列どころかそのペプチドに含まれるアミノ酸が何なのか分かりません。
データベース中の既知のタンパク質と同じであれば、
配列が既知なので、データベースからアミノ酸配列が分かります。

de novoシークエンスタグ法はやったことが無いので、
自分で何を解析することによって、何を知ることが出来るのかを調べてください。

直接ペプチドの配列を知りたいのならば、
MS/MSを使います。

お礼

回答ありがとうございます。
つまり、多量にあるペプチドの質量のデータから先にタンパク質を同定して、その後
タンパク質のデータベースからアミノ酸の配列を同定するということでよろしいのでしょうか。

回答No.1

miya_0726

一言で言えば力ずくです。

タンパク質全体では長すぎるため、まずはトリプシンで分解し、小さいペプチド断片にします。トリプシンはエンドペプチダーゼですから、特定の配列を認識してタンパク質を切断するので、切断後のペプチドの大きさで分離すれば同じペプチド配列の集合が得られますね。
それぞれのペプチド断片を今度はランダムに切断し、様々な長さのオリゴペプチド断片を作ります。これを片っ端から質量分析にかけることで、オリゴペプチドの重さを網羅的に取得します。

この作業をやったら、次はコンピュータの出番です。
ランダムに切断したオリゴペプチドの質量を測定すると、ほぼ確実に1アミノ酸分だけ質量が違うような2本のオリゴが得られます。そうすると、「あるアミノ酸グループの隣にあるアミノ酸はXである」と決定できます。このようなペアをかき集め、質量から計算したオリゴペプチドのアミノ酸組成と突き合わせることで、アミノ酸の配列を決定していくのです。

例えば、アミノ酸n個分の重さを持つオリゴと、それに+アミノ酸1個の重さ分だけ重いオリゴが得られれば、(1)アミノ酸n個分の重さからその組成、(2)さらにそのどちらか隣に付くアミノ酸が特定できます。
このような具体例を大量に集め、いろいろ試行錯誤しながら並べてパズルのように解いていくのです。

お礼

回答ありがとうございます。
なるほど、アミノ酸一つ分質量が違えばそのアミノ酸は特定できますね。たしかにパズルみたいです。
ただ一つ疑問なのですが、トリプシンはリシンとアルギニンのペプチド結合を切る酵素ですよね。
切る位置が決まっているのに１アミノ酸分だけ質量が異なるペプチドをすべて得られるのでしょうか。