電気泳動の失敗原因

質問

アクリルアミドゲルで電気泳動したのですが，ゲルをCBB染色して確認したところ，サンプルが泳動後すぐのところでかたまりになって流れていませんでした。その原因として考えられるのは何でしょうか。
アクリルアミドゲルは，running gelをアクリルアミド12.5%で作り，stacking gelを4%で作りました。単純に，ゲルが均一でなかったということなのでしょうか。

よろしくお願いいたします。

回答No.2

lamb1204 · ベストアンサー

1です。
補足が無いのでSDS-PAGEと思って再度回答します。

>2日も保存しているとタンパク変性してしまったのでしょうか・・・
SDS-PAGEであればもともと変性してると思います。

熱処理後4℃に保存していたということですが、普通4℃ではサンプル中のSDSは析出してしまいます。サンプル中にキラキラした、あるいは白い結晶が出来ていませんでしたか？もしそうなら、タンパク質のSDS化が不十分な状態に戻ってしまっています。室温に戻って溶けたとしても、出来れば再度boilしましょう。還元剤に2-MEを使っているのなら、少量加えなおしてもいいかもしれません。それから、SDSが析出する際には、一部のプロテアーゼが巻き戻って目的タンパク質を分解してしまうおそれがあります。保存は、-20℃以下で凍結保存することをオススメします。

お礼

ありがとうございました。
再び条件を整えて行いましたところうまく行きました。

補足

何度もありがとうございます。
SDS-PAGEを行いました。

サンプル中の結晶には気がつきませんでしたが，お話を聞いているうちにサンプルの問題である気がします。勉強になりました。

ありがとうございました。
次回から注意深く進めたいと思います。

回答No.1

lamb1204

サイズマーカーは同時に泳動しましたか？

サイズマーカーも同様に流れないのであれば、問題はゲルをはじめとする泳動条件ということになります。泳動後すぐのところというのは、濃縮ゲルということでしょうか。ゲルの下端の気泡はしっかり除きましたか？upperのbufferに少量のBPBを加えて、泳動先端（正確な泳動先端は屈折で確認します）を視覚的に確認しながら泳動してはどうでしょうか？

サイズマーカーは流れる、ということになると原因はサンプルにあることになります。Native PAGEならば、タンパク質が凝集していて流れないようなサイズになっているかもしれませんし、電化的に丁度ほとんど流れないのかもしれません。SDS-PAGEなのであれば、サンプルのSDS化が適切では無い可能性が高いと思います。サンプル中のタンパク質のサイズは、もっと流れてもいいサイズのはずなんですよね？

正確なアドバイスのためには情報がたりません。Native-PAGEなのかSDS-PAGEなのか、サンプルはどのようなものでどんな処理をしたか。泳動方法の原理と、自分の条件を照らし合わせて、何がおかしいのか考える必要があります。

補足

早速のご連絡ありがとうございました。

サイズマーカーは流れていました。また，サンプルは2日ほど前に作製したもの（95℃でheat blockしましてS-S結合は切りました）を4℃の冷蔵庫で保存しておいたものです。作成日に先輩が流した時はちゃんと泳動できておりましたし，バンドもフィルムに写っていました。2日も保存しているとタンパク変性してしまったのでしょうか・・・

「泳動後すぐ」の表現ですが，Running Gelなので濃縮ゲルではありません。ゲル下の気泡は先輩にもチェックしてもらいましたので除きました。