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ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の脱顆粒現象に関して
マスト細胞モデルであるＲＢＬ－２Ｈ３細胞を購入したのですが、文献に従って脱顆粒させようとしてもしません。細胞内の顆粒が動くのは確認できるのですが、いわゆる脱顆粒はしません。刺激はＡ２３１８７、抗原抗体反応、ブラジキニン、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８/８０、ＣｏｎＡ、マストパラン・・・文献に従って、あらゆるものを試してみました。培養方法も購入先のマニュアルにしたがっています。培養条件、刺激条件等検討してみましたが、コツみたいなものがあるのでしょうか。何卒、宜しくお願いいたします。
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RBL-2H3細胞の脱顆粒反応をβ-ヘキソサミニダーゼの酵素活性で評価しようと考えて実験を重ねているのですが一向に脱顆粒がおきてくれません。 刺激はIgEと抗原、あるいはA23187で行っていて、 培地はRPMI1640で刺激時は1％BSA含有タイロードバッファーです。 ちなみに細胞密度は3×10^5で、96ウェルに100μL撒いてます。 色々と反応条件を変更してみたりしたのですが一向にうまくいかず、 しかも細胞内量を測定すると普通に測定できているので酵素反応が悪いというわけではなさそうです。 つまりなぜだかわからないけど脱顆粒だけがうまくいかないという状況です。 同じような経験をされた方や原因を思いつく方がおられましたらアドバイスをください。 よろしくお願いします。
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お返事ありがとうございます。以下に、実験条件を示します。 培養条件 RPMI-1640 10%FBS,または RPMI-1640 15%FBS 70%コンフルまで培養し、siraganinan bufferで３回洗浄後、37℃で、 刺激１ 5uM A23187 (siraganinan buffer) 4uM A23187 (siraganinan buffer) 1uM A23187 (siraganinan buffer) 500nM A23187 (siraganinan buffer) 刺激２ bradykinin f=5ug/mL 刺激３ ConA f=50ug/mL IgE f=0.5ug/mLでインキュベート（一時間、またはオーバーナイトで）後、 刺激４ DNP-BSA f=20ng/mL です。宜しくお願いいたします。