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northern blotで用いるprobeの作り方

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northern blotで用いるプローブをPCR産物からつくる方法を教えてください。ある薬物をラットに投与すると肝臓内のacyl-CoA oxidase活性が上がりました。RT-PCR(リアルタイムではない)で遺伝子発現が上がっているのは明らかなのですが、定量性に欠けるということで、northern blotをしたいのですが、このときのプローブを作りたいのです。よく論文でPCR産物をプローブにしてノーザンを行っている論文を見ますが(論文では当たり前のようにプライマーの配列が書いてあり、次の文ではP32でラベルし、、、で終わっているものばかりでこの過程がわかりません)、単にPCR産物をアガロースゲルで分け、取りだし、P32あるいはDIGでラベルをするだけでよいのか、あるいは複雑な工程があるのか教えてください。いままでノーザンをしたことはあるのですがプローブはもらいものだったもので大事なことがわかりません。またこのPCR産物をプローブに用いる方法は当たり前なのか、どのくらい量がとれるか(ようは菌で増やさなくてもいいくらいの量か)、欠点、長所、よく書かれた成書があれば教えてください。
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単にPCR産物をアガロースゲルで分け、取りだし、P32あるいはDIGでラベルをするだけでよいです。 PCR産物をプローブに用いる方法は当たり前です。昔は、制限酵素でベクターから切り出していました。ノーザンなら、ベクターごとインサートをラベルしている人もいましたが、あまりお勧めではないですね。 大腸菌を増やして、plasmidをとって、切り出して使うのと、PCRして精製して使うのの違いです。よく ...続きを読む
単にPCR産物をアガロースゲルで分け、取りだし、P32あるいはDIGでラベルをするだけでよいです。

PCR産物をプローブに用いる方法は当たり前です。昔は、制限酵素でベクターから切り出していました。ノーザンなら、ベクターごとインサートをラベルしている人もいましたが、あまりお勧めではないですね。

大腸菌を増やして、plasmidをとって、切り出して使うのと、PCRして精製して使うのの違いです。よく書かれた成書はないと思います。単純なことですから。


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