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アニ-リングについて(専門知識は持っていません)
ショットガン実験について調べていたのですが、 アニ-リングをする時に切断したDNA同士が再びくっつくことはあるのですか? 全てが上手いことにプラスミドDNA断片とくっつくとは思えないのですが…。
- chief_0527
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まず、用語の訂正ですが、DNA断片同士を結合することは、ふつうライゲイション(ligation)といいます。この反応を触媒する酵素がライゲイス(リガーゼ、ligase)です。アニーリング(annealing)は、鋼鉄などを「焼き戻し」するというのが原意で、DNA二重鎖が熱で一本鎖に解離したものを、ゆっくり冷ますと、相補鎖がふたたび対合して二本鎖にもどる現象を意味しました。今では、広く相補鎖同士が対合することを意味します。ライゲイションのときもDNA断片の相補な突出末端で「アニーリング」するとも言えますが、ふつうそういう表現はしません。 さて、ご質問について。 これはショットガン法に限らず、クローニング一般についてですが、 >DNA同士が再びくっつくことはあるのですか ありえます。そのためにふつう、DNA断片の分子数に対し、ベクターの分子数が過剰になるようにして、DNA断片同士が出会う確立より、ベクターと出会う確立の方が高くなるようにします。ベクター同士のライゲイションや、ベクター自身がライゲイションしてもとにもどる可能性も高くなりますが(self-ligation)、これを防ぐためにベクターの末端を酵素で脱リン酸しておきます(DNA鎖の5'末端にリン酸基がついていないもの同士だと、結合できません)。それでも、複数のDNA断片がキメラになってクローニングされることもまれではありません。 別の方法としては、逆にDNA断片の方を脱リン酸化して、それら同士が結合しないようにします。ベクターの方は脱リン酸する変わりに、2つのクローニングサイトを異なる制限酵素できって、self-ligationしないようにするとか、no insertのベクターがでは生えてこないような宿主/ベクター系をつかったりします。ほかにも、ベクターがもつinsertの長さの制限を利用して、複数のDNA断片が組み込まれると無効になるようにする、などなど、いろいろなトリックがあります。 ながくなりましたが、
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