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HPLC分析における除タンパク法

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お礼率 96% (291/302)

「イカの沖漬け(イカを姿のまま、味付け醤油に漬けたもの)」の、旨味成分(アミノ酸、有機酸、核酸)をHPLCで分析しようとしています。除タンパクのため、10,000のフィルタで限外ろ過していますが、なかなかろ液が集まらずに困っています。良い除タンパクの方法を教えてください。TCAで沈殿させる方法もあるとは思うのですが、その場合、除タンパク後の上澄みと、移動相のpHが異なってくるのではないかと気になります。
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  • 回答No.2
レベル8

ベストアンサー率 29% (12/41)

補足です。
バリデーションとは、分析の信頼性を担保するために、分析法開発の前段階で行うものです。ピーク面積や高さで定量を行うのであれば、濃度とピーク面積(高さ)との相関が認められるか(5点程度の濃度のスタンダード試料を測定し、濃度とピーク面積(高さ)との相関係数を求める)、定性ならば繰り返し測定したときの保持時間のずれはないか、試料溶液の安定性はどうかなどを確認します。
今回の問題では、除タンパク時の目的成分の回収率が問題になります。共沈により、タンパク中に目的成分が一部取り込まれて、見かけの測定値が低くなってしまうおそれがあります。具体的にどのような操作を行われているかわかりませんが、沈殿除去したタンパク分から再度抽出し、目的成分が検出されない等の確認が必要と思われます。ただし、これらは分析の目的が定量とか各成分の面積比を知りたい場合であって、保持時間による定性のみが目的であれば必要ないでしょう。
あと、サンプルと移動相の組成が異なる場合のことを心配しておられますが、保持時間による定性の場合は、試料の溶媒強度やpHによって保持時間のずれや理論段数・分離度が変わる可能性があります。
定量の場合は原則、標準溶液を測定し、その値との比較を行うことになると思いますので、標準溶液についても試料サンプルと同様の操作を行えば問題はありません。アミノ酸等の標準物質を精密に量り、試料サンプルと同様に操作して得られた液を標準溶液として、同時に分析すれば、移動相と組成が異なっても大丈夫です。各種文献等においても、メタノールで抽出しアセトニトリルで分析するとか、いろんな事例がありますので。
アミノ酸分析で発色法により検出する場合は、意外な成分が発色してベースをあげたり、変なピークがでてきますので、試薬や機器等は綺麗にしておくことが大切です。

がんばってね。
お礼コメント
hikobae

お礼率 96% (291/302)

詳しい解説ありがとうございます。
お礼が遅くなって申し訳ございませんでした。
本当にありがとうざいます。
がんばります。
また、質問することがあると思いますがよろしくお願いします。
投稿日時 - 2001-08-28 12:35:59
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  • 回答No.1
レベル8

ベストアンサー率 29% (12/41)

私は、ヒト血液の分析を行ったことがありますが、その場合も血漿中の除タンパクが問題となります。移動相の組成にもよりますが、血漿の場合は、等量のアセトニトリルを加えるだけでタンパクはほぼ除去できます。TCAや過塩素酸などは除タンパク効果は高いですが、確かにpHがずれてしまいますので、同時にスタンダードをたてて、全く同じ操作をする必要があります。 いずれにせよ、除タンパクのために何かを添加すると、共沈により測 ...続きを読む
私は、ヒト血液の分析を行ったことがありますが、その場合も血漿中の除タンパクが問題となります。移動相の組成にもよりますが、血漿の場合は、等量のアセトニトリルを加えるだけでタンパクはほぼ除去できます。TCAや過塩素酸などは除タンパク効果は高いですが、確かにpHがずれてしまいますので、同時にスタンダードをたてて、全く同じ操作をする必要があります。
いずれにせよ、除タンパクのために何かを添加すると、共沈により測定対象の回収率が悪くなる可能性があるため、分析法のバリデーションが必要です。
食品分析はやったことがないのですが、参考になれば..
お礼コメント
hikobae

お礼率 96% (291/302)

アドバイスありがとうございます。
ほとんどビギナーなもので・・・・・、あの「バリデーション」ってなんですか?「複数の方法で除タンパクしてみて、良い方法を選択する」っていう意味でしょうか?

それと、移動相にもおそらくアセトニトリルをお使いかと思うのですが、アセトニトリルで除タンパクする場合、移動相のアセトニトリルの濃度と、除タンパク後のサンプルのアセトニトリルの濃度が極端に違うことになりはしないかと、ふと、思ったのですが、分析に影響はないものでしょうか?
アドバイスよろしくお願いします。
投稿日時 - 2001-08-08 11:30:50


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